張 晨，葉晨曦，熊二輝，武麗敏

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311112)

土壤鹽堿化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要問(wèn)題之一，全世界約有1/5的農(nóng)田受高鹽堿化的影響[1].水稻對(duì)鹽脅迫較為敏感，特別是在幼苗期和生殖期，土壤鹽堿化通過(guò)滲透脅迫、離子平衡和離子毒害等方式嚴(yán)重阻礙水稻的生長(zhǎng)和發(fā)育[2].鹽脅迫是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在植物體內(nèi)誘導(dǎo)一系列生理生化反應(yīng)，如種子萌發(fā)受阻[3]、生長(zhǎng)受到抑制、光合能力下降[4]、膜透性增加和生物量下降[5].活性氧是有氧呼吸的代謝產(chǎn)物，主要包括過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧自由基(O2·-)等[6]，鹽脅迫下植物體內(nèi)活性氧平衡被打破，這些活性氧自由基對(duì)水稻植株的蛋白質(zhì)、質(zhì)膜、葉綠素及其他細(xì)胞組分造成損傷，而此時(shí)植物細(xì)胞會(huì)通過(guò)抗氧化防御機(jī)制嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度[7].一旦體內(nèi)負(fù)責(zé)清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶、脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶等酶活力下降，則會(huì)引起活性氧的大量積累，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化、生物膜系統(tǒng)受損，進(jìn)而對(duì)植物的光合作用、呼吸作用等造成影響，使其能耗增加，衰老加速，最終導(dǎo)致植株死亡[6,8].

為了闡明水稻耐鹽的遺傳機(jī)制，篩選耐鹽或鹽敏感水稻突變體、克隆其相關(guān)基因已經(jīng)成為挖掘水稻耐鹽新基因的有效策略[9].迄今，多個(gè)與水稻耐鹽性相關(guān)的QTL已被定位，但目前僅有少數(shù)耐鹽性相關(guān)QTL被克隆.已知的水稻耐鹽相關(guān)基因來(lái)自不同代謝途徑，在不同的組織器官中受鹽脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá)[10].這些耐鹽相關(guān)基因可以分為：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因[11]、轉(zhuǎn)錄因子[12]、酶編碼基因[13]、MicroRNA編碼基因[14]以及其他功能蛋白編碼基因[15].其中，鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT在維持植物體內(nèi)K+、Na+平衡中起著重要作用，其過(guò)量表達(dá)可以提高植物的抗鹽性[10]；此外，在鹽脅迫下，MYB轉(zhuǎn)錄因子過(guò)量表達(dá)可提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[16].

水稻對(duì)鹽脅迫的耐受性是受多種因素共同調(diào)控的，涉及生理、生化、細(xì)胞等多方面的響應(yīng)[17]，這些因素之間的相互作用機(jī)理目前仍不清楚.本研究通過(guò)對(duì)水稻甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)誘變的突變體庫(kù)進(jìn)行鹽脅迫處理，篩選獲得了1個(gè)水稻鹽敏感突變體，命名為ssm1(salt sensitive mutant 1),該突變體在鹽脅迫條件下葉片發(fā)生明顯卷曲，衰老加速、死亡，此外，ssm1還具有葉片早衰表型.通過(guò)高溫(45 ℃)、低溫(4 ℃)、干旱(20% PEG)和鹽(1% NaCl)脅迫處理，發(fā)現(xiàn)ssm1對(duì)鹽表現(xiàn)出專(zhuān)一敏感性.本研究通過(guò)鹽處理前后，ssm1突變體的體內(nèi)生理變化，探究SSM1參與水稻鹽脅迫耐受分子機(jī)理，為指導(dǎo)育種實(shí)踐提供重要的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用的水稻材料為蜀恢527(野生型，WT)和ssm1鹽敏感突變體.其中，ssm1是水稻品種蜀恢527經(jīng)EMS誘變處理獲得，經(jīng)連續(xù)多代自交，突變性狀遺傳穩(wěn)定.

種子浸種置于30 ℃恒溫箱，3～4 d后將發(fā)芽的水稻種子播種于人工氣候室中.人工氣候室的培養(yǎng)條件為：恒溫30 ℃，光照及黑暗時(shí)間分為14 h/10 h，光照強(qiáng)度為50～100 μmol·m-2·s-1.營(yíng)養(yǎng)液母液配方見(jiàn)表1(使用過(guò)程中需要稀釋至1×使用).

表1 營(yíng)養(yǎng)液母液配方Tab.1 Rice nutrient solution formula

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫處理

選取生長(zhǎng)狀況良好兩周的水稻幼苗，分別于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫處理48 h，4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理48 h，含20% PEG營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行干旱處理24 h以及含1% NaCl營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行鹽脅迫處理24 h，對(duì)比分析野生型和突變體生長(zhǎng)狀態(tài)和生理指標(biāo)差異.

1.2.2 H2O2含量分析(DAB染色)

利用DAB染色分析1% NaCl處理前后WT和ssm1突變體葉片中H2O2含量.染色液配制：取50 mg的DAB，加入45 mL的水，攪拌均勻使之完全溶解，然后用0.2 M的鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0后，加入25 μL的吐溫20，再加入2.5 mL 0.2 M的Na2HPO4，攪拌均勻，加H2O至50 mL.鹽脅迫處理前后的新鮮葉片完全浸沒(méi)于DAB染色液中，真空泵中緩慢抽真空，2次，每次5 min，避光染色12 h后置于脫色液(V乙醇∶V乙酸∶V甘油= 3∶3∶1)中脫色.

1.2.3 MDA和T-AOC測(cè)定

水稻生長(zhǎng)至四葉期后，選取生長(zhǎng)狀況良好且均一的水稻W(wǎng)T和ssm1突變體置于含1% NaCl的營(yíng)養(yǎng)液中處理 0、1、24 h，取新鮮葉片用于丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定，試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Solarbio生物技術(shù)公司(BC0025 和 BC1310).T-AOC測(cè)定原理：在酸性環(huán)境下，還原 Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的 Fe2+-TPTZ 的能力反映了總抗氧化能力.我們利用分光光度計(jì)測(cè)定Fe2+-TPTZ 的顏色吸光度大小來(lái)反映總抗氧化能力的多少.取0.1 g新鮮葉片置于1 mL磷酸緩沖液(50 μmol/L,pH 7.0)中研磨成勻漿，8 000 g 離心10 min，上清在波長(zhǎng)593 nm下測(cè)定T-AOC的吸光度，在波長(zhǎng)532 nm 和600 nm下測(cè)定MDA的吸光度.

1.2.4 耐鹽相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定

取鹽處理 0、1、6 h 野生型和ssm1突變體水稻葉片樣品各 0.1 g，液氮迅速冷凍置于-80 ℃冰箱，保存?zhèn)溆?采用 Trizol 法(康為世紀(jì))提取水稻總RNA，NanoDropTM2000測(cè)定濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMII1st Strand cDNASythesis Kit(Takara)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.選取耐鹽相關(guān)基因OsHKT1;1和OsMYB2，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鹽處理前后WT和ssm1中相對(duì)表達(dá)量.分別以WT和ssm1的cDNA為模板，以Actin為內(nèi)參，反應(yīng)體系(10 μL)∶cDNA template 1 μL，2×SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 3 μL，3個(gè)重復(fù)，在熒光定量PCR儀(Bio Rad CFX96)上反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán).

表達(dá)量計(jì)算公式：

ΔCT(test)= CT(target,test)-CT(ref,test),

ΔCT(calibrator)=CT(target,calibrator)-CT(ref,calibrator),

ΔΔCT=ΔCT(test)-ΔCT(calibrator), 2-ΔΔCT=表達(dá)量比值.

引物見(jiàn)表2.

表2 相關(guān)基因引物Tab.2 Related primers in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 ssm1突變體篩選

利用EMS處理野生型水稻，我們共獲得了含5 000份材料的水稻突變體庫(kù).通過(guò)對(duì)該突變體庫(kù)進(jìn)行鹽脅迫處理，獲得了多個(gè)鹽耐受性改變的材料，其中一個(gè)命名為ssm1.研究發(fā)現(xiàn)，在1%鹽濃度脅迫處理后，突變體ssm1幾乎全部枯黃致死，而野生型只有部分葉片枯黃(圖1b).ssm1突變體存活率不足6%，而野生型植株存活率為92%.上述結(jié)果表明，與野生型相比，ssm1突變體對(duì)鹽脅迫敏感.

a:野生型和ssm1突變體2周苗表型; b:野生型和ssm1突變體1% NaCl脅迫處理10 d后表型;c:統(tǒng)計(jì)分析鹽脅迫處理10 d后野生型和ssm1突變體存活率.Bar=2 cm.

2.2 ssm1突變體表型分析

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在四葉期時(shí)ssm1突變體葉片表現(xiàn)出黃色條斑表型(圖2a和b)，并持續(xù)至整個(gè)生命周期(圖2c和d)；而且伴隨葉片衰老，植株也出現(xiàn)株高變矮表型(圖2c).說(shuō)明ssm1不僅參與植物鹽脅迫調(diào)控和葉片衰老，同時(shí)影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育.

a:WT和ssm1四葉期表型; b:WT和ssm1四葉期葉片表型; c:WT和ssm1分蘗期植株表型;d:WT和ssm1分蘗期葉片表型.

2.3 鹽脅迫影響ssm1突變體葉片中H2O2積累

圖3 鹽脅迫影響ssm1突變體葉片中H2O2積累Fig.3 Salt stress affects H2O2 accumulation in ssm1 mutant leaves

脅迫能引起水稻活性氧的積累，造成水稻植株氧化損傷，影響植株正常的生長(zhǎng)和發(fā)育，甚至導(dǎo)致植株死亡[20].DAB染色是一種簡(jiǎn)單有效的定性測(cè)定H2O2含量的方法，已被廣泛應(yīng)用于水稻[21]和小麥[22]等農(nóng)作物研究.為探尋ssm1突變體在鹽脅迫條件下葉片中H2O2積累的情況，我們對(duì)鹽處理不同時(shí)期的野生型和ssm1突變體葉片進(jìn)行了DAB染色分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理前突變體中H2O2含量高于野生型(圖3a).此外，盡管鹽脅迫處理后均引起野生型和突變體葉片中H2O2積累，但是在ssm1突變體中H2O2的積累量顯著高于野生型(圖3b、c和d).說(shuō)明鹽脅迫影響ssm1突變體葉片中H2O2的積累.

2.4 鹽脅迫影響ssm1突變體MDA積累和總抗氧化能力

MDA是植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)之一，較高的MDA含量說(shuō)明植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度高，細(xì)胞膜受到傷害，同時(shí)也降低了植物的耐鹽性[23].因此我們對(duì)鹽處理前后葉片中的MDA含量進(jìn)行了測(cè)定(圖4a).結(jié)果顯示，無(wú)論是鹽處理前后(0和24 h)，ssm1葉片中MDA積累量以及上升速率顯著高于野生型，說(shuō)明ssm1葉片中細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度高于野生型，且隨著鹽脅迫時(shí)間的增加而加劇，該結(jié)果與鹽脅迫處理后ssm1突變體中H2O2含量顯著高于野生型的結(jié)果相符.此外，對(duì)鹽處理前后水稻葉片中總抗氧化能力測(cè)定(圖4b)發(fā)現(xiàn)，鹽處理24 h后野生型和突變體總抗氧化能力均低于處理前，無(wú)論是鹽脅迫處理前還是鹽處理后野生型總抗氧化能力均顯著高于ssm1突變體，推測(cè)鹽脅迫處理前期由于植株應(yīng)激反應(yīng)引起植株總抗氧化能力的提高，但隨著脅迫程度的加深總抗氧化能力隨之降低[7].

a:WT和ssm1突變體MDA的含量; b:WT和ssm1突變體T-AOC.

2.5 鹽脅迫影響ssm1葉片中耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)

為探究鹽脅迫對(duì)ssm1葉片中耐鹽相關(guān)基因表達(dá)量的影響，利用qRT-PCR對(duì)鹽脅迫前后野生型和ssm1突變體葉片中OsMYB2和OsHKT;1的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果顯示，在鹽脅迫處理前，ssm1突變體葉片中OsMYB2和OsHKT;1的表達(dá)量均顯著高于野生型，由此可以推測(cè)，與野生型相比，水稻ssm1突變體在鹽脅迫處理前可能就處于一種脅迫狀態(tài).鹽處理1 h后這兩個(gè)基因在野生型和ssm1突變體中的表達(dá)量均上調(diào)，但此時(shí)ssm1中的表達(dá)量卻低于野生型，尤其是OsMYB2在ssm1中的表達(dá)量，僅為野生型的1/2.隨著鹽脅迫處理時(shí)間的增加(6 h)，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和ssm1水稻突變體中的表達(dá)量下調(diào)，此時(shí)OsHKT;1在ssm1突變體中的表達(dá)量為野生型的2/3，OsMYB2在ssm1突變體中的表達(dá)量已不足野生型的1/20(圖5).這些耐鹽基因表達(dá)模式的改變，可能是ssm1突變體對(duì)鹽敏感的主要原因.

圖5 鹽脅迫影響ssm1突變體葉片中耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)Fig.5 Salt stress affects the relative expression of salt tolerance related-genes in ssm1 mutant leaves

3 討論

植物在正常的生長(zhǎng)條件下，體內(nèi)酶和非酶系統(tǒng)使活性氧的產(chǎn)生和清除維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡之中，然而，在鹽脅迫下，這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，體內(nèi)的活性氧迅速產(chǎn)生并積累，對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的破壞作用[24].本研究通過(guò)對(duì)EMS誘變的種庫(kù)進(jìn)行鹽敏感性材料篩選獲得了一個(gè)鹽敏感突變體ssm1.此外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ssm1突變體具有早衰表型(圖2)，因此SSM1不僅參與鹽脅迫調(diào)控，且調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育.

DAB染色是定性檢測(cè)過(guò)氧化氫含量的有效手段之一[25]，對(duì)鹽脅迫處理前后的野生型和突變體葉片進(jìn)行DAB染色，結(jié)果顯示鹽脅迫處理后突變體中過(guò)氧化氫積累量以及積累速率顯著高于野生型(圖3)，過(guò)高的過(guò)氧化氫積累可能是引起突變體對(duì)鹽脅迫敏感的原因之一.MDA含量和總抗氧化能力檢測(cè)結(jié)果表明，鹽脅迫處理后突變體葉片中MDA的含量顯著高于野生型(圖4)，且此時(shí)突變體的總抗氧化能力也顯著低于野生型(圖4)，該結(jié)果與H2O2的結(jié)果相符(圖3).以往研究表明，植物體內(nèi)積累的過(guò)氧化氫和MDA可能是由于抗氧化物酶系統(tǒng)紊亂引起的[26].在水稻ssm1突變體中抗氧化物酶活性的紊亂導(dǎo)致植株積累大量的過(guò)氧化氫和MDA，活性氧的積累引起膜脂質(zhì)氧化程度高，導(dǎo)致膜透性改變、抗氧化能力下降，促使植物細(xì)胞死亡.

植物對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答過(guò)程中發(fā)生的一系列生理生化變化，是復(fù)雜的內(nèi)在分子機(jī)制調(diào)控的結(jié)果.水稻中存在許多鹽脅迫相關(guān)的基因，如MYB2[16]、SOS1[27]、SOS2[27]和HKT1[28]，這些基因在鹽脅迫條件下起著重要作用.OsMYB2是MYB基因家族中編碼R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因[16]，該轉(zhuǎn)錄因子在水稻響應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用[26]；OsHKT;1是HKT基因家族水稻OsHKT;1鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因，該鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體參與提高水稻耐鹽性[10].在鹽脅迫處理前，OsMYB2和OsHKT;1在突變體中的表達(dá)量略高于野生型，這可能是由于突變體已處于脅迫狀態(tài)，OsMYB2和OsHKT;1基因上調(diào)表達(dá)參與脅迫調(diào)控.隨著處理時(shí)間的增加，在鹽脅迫處理時(shí)間2 h左右，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和突變體中的相對(duì)表達(dá)量比處理0 h時(shí)均有所上升，說(shuō)明鹽脅迫處理后，野生型和突變體中OsMYB2和OsHKT;1均上調(diào)表達(dá)參與鹽脅迫響應(yīng)，然而野生型增長(zhǎng)速率顯著高于ssm1突變體，且野生型的表達(dá)量略高于突變體，說(shuō)明突變體在鹽處理?xiàng)l件下的脅迫響應(yīng)能力低于野生型.然而隨著鹽脅迫處理時(shí)間的增加(6 h)，OsMYB2和OsHKT;1在野生型和ssm1水稻突變體中的表達(dá)量均下調(diào)且突變體中的表達(dá)量顯著低于野生型.由此可以推測(cè)，與野生型相比，突變體中鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的降低可能引起大量Na+進(jìn)入細(xì)胞，耐鹽相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)可能是引起植株鹽耐受性下降的重要原因.

綜上所述，SSM1基因的突變，導(dǎo)致在鹽脅迫條件下，ssm1突變中過(guò)氧化氫和MDA大量積累，活性氧的積累進(jìn)而引起膜透性改變、植株抗氧化能力降低，并造成鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)量下調(diào)，外源的Na+大量進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡.