方敏溪，俞 倩，易 敏，楊愛芬，徐曉鋒

(杭州師范大學(xué)生命科學(xué)研究院，浙江省器官發(fā)育與再生技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311121)

0 引言

少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocytes, OLs)由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyte precursor cells, OPCs)經(jīng)過增殖、遷移、分化形成，是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)唯一的髓鞘形成細(xì)胞[1].髓鞘包裹在神經(jīng)元周圍能夠確保神經(jīng)沖動在神經(jīng)元快速準(zhǔn)確地傳導(dǎo)[2].近年來的研究表明，由于OLs譜系分化成熟障礙、再生受阻或者OLs功能低下，導(dǎo)致髓鞘結(jié)構(gòu)或功能異常與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生相關(guān)，如多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)、橫貫性脊髓炎(transverse myelitis)以及阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease)等[3-5].刺激CNS內(nèi)保留的OPCs向OLs的再分化和重新髓鞘化將成為治療脫髓鞘相關(guān)疾病的有效途徑之一.

隨著表觀遺傳學(xué)概念的不斷深化和研究方法的發(fā)展，包括DNA甲基化和組蛋白修飾在內(nèi)的表觀遺傳調(diào)控在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育和脫髓鞘疾病治療中的作用逐漸引起人們的關(guān)注[6].高等動物的DNA甲基化一般發(fā)生在鳥嘌呤二核苷酸(CpG)上，CpG序列中胞嘧啶的甲基化會關(guān)閉基因啟動子的活性，從而抑制其表達(dá)[7].研究顯示，許多脫髓鞘神經(jīng)退行性疾病存在DNA甲基化的改變，MS患者腦組織中DNA去甲基化的活性比正常人腦組織高出了兩倍[8]，因此，DNA甲基化可能作為MS疾病活性標(biāo)記物.其中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A (DNA methyltransferases 3A,DNMT3A) 負(fù)責(zé)催化DNA的從頭甲基化，參與調(diào)控多種器官的發(fā)育.分離Dnmt3a基因敲除小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)分化為神經(jīng)元的細(xì)胞數(shù)量減少，分化為膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增多[9]，表明DNMT3A介導(dǎo)的DNA甲基化參與調(diào)控神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的命運特化.目前為止，DNMT3A對體內(nèi)OPCs分化和OLs發(fā)育的調(diào)控作用還未見報道.本研究以Dnmt3a全局性敲除小鼠為對象，分析敲除Dnmt3a對少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNMT3A功能缺失后造成OLs分化的延遲，處于未分化狀態(tài)的OPCs數(shù)量增加.因此，DNMT3A對于小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的正常發(fā)育是必需的.

1 材料和方法

1.1 動物

表1 Dnmt3a小鼠基因型鑒定引物[10]Tab.1 The genotyping primer of Dnmt3a mice

Dnmt3a+/-品系(Stock No: 018838)小鼠從美國Jackson Lab平臺購置，特異性缺失Dnmt3a基因組第13至第17個外顯子序列，已被廣泛用于研究Dnmt3a基因敲除后對不同組織或器官發(fā)育的影響.本實驗用到的全局性Dnmt3a敲除小鼠(Dnmt3a-/-)，是由Dnmt3a+/-雜合小鼠相互交配獲得.得到的后代采取堿裂解法鑒定基因型，鑒定引物如表1所示(由Jackson Lab平臺提供).

1.2 脊髓組織取材

收集出生前后不同時期(E14.5，E16.5，E18.5，P0，P3，P7和P10)小鼠脊髓組織.胚胎期小鼠直接剝離新鮮組織，用預(yù)冷的PBS潤洗后置于4%多聚甲醛(PFA)中固定過夜.出生后小鼠先依次用PBS和4%PFA進(jìn)行灌注，然后分離出脊髓組織，置于4%PFA中固定過夜.次日將組織轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中進(jìn)行脫水處理，4 ℃放置過夜.隨后，將組織放入OCT包埋劑中，-80 ℃保存.

1.3 RNA原位雜交

RNA原位雜交用小鼠脊髓組織切片厚度為18 μm.RNA原位雜交第1天，提前將組織切片從-80 ℃取出，恢復(fù)至室溫.50 ℃烘烤30 min，4%PFA室溫固定10 min，然后依次經(jīng)過蛋白酶K消化，4%PFA再固定以及乙酸酐處理，用不含探針的雜交液室溫孵育至少1 h.最后，用含RNA探針(終濃度為0.1～0.2 ηg/μL)的雜交液于65 ℃孵育過夜.RNA原位雜交第2天，將多余雜交液洗脫，用含10%綿羊血清的封閉液封閉至少1 h，用含偶聯(lián)堿性磷酸酶(AP)的抗地高辛抗體于4 ℃孵育過夜.RNA原位雜交第3天，將多余的抗體洗脫，使用NBT/BCIP顯色液室溫避光顯色，至由明顯藍(lán)紫色信號出現(xiàn)終止顯色反應(yīng).甲醇洗脫背景色，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照.

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本文中的數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計分析作圖，重復(fù)樣本數(shù)n≥3，通過t檢驗對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)P<0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 Dnmt3a在不同發(fā)育時期小鼠脊髓組織中的表達(dá)

為了確定Dnmt3a的空間表達(dá)模式，我們通過RNA原位雜交檢測了不同發(fā)育時期小鼠脊髓組織中Dnmt3a的表達(dá).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期Dnmt3a在灰質(zhì)區(qū)域新分化或成熟的神經(jīng)元中廣泛表達(dá).從E14.5開始，白質(zhì)區(qū)域開始出現(xiàn)零星分布的Dnmt3a+細(xì)胞(圖1 A).隨著發(fā)育的進(jìn)行，白質(zhì)中Dnmt3a+細(xì)胞逐漸增多(圖1 B)，一直持續(xù)到P7(圖1 C)，隨后Dnmt3a在該區(qū)域的表達(dá)逐漸消失.Dnmt3a在白質(zhì)中的表達(dá)時期正是脊髓組織中少突膠質(zhì)細(xì)胞開始大量分化的時期，暗示其可能參與調(diào)控該過程.

A-C:Dnmt3a在E14.5, E18.5和P7野生型小鼠脊髓中的RNA原位雜交結(jié)果. E14.5期開始在白質(zhì)區(qū)域表達(dá)，持續(xù)至P7. 箭頭表示Dnmt3a在白質(zhì)中的表達(dá).

2.2 Dnmt3a基因敲除對少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響

與已有報道一致，Dnmt3a純合突變小鼠(Dnmt3a-/-)呈現(xiàn)發(fā)育不良、個體矮小、小腦畸形等表型，出生后三周左右死亡[10].為了判斷Dnmt3a敲除是否會造成OLs發(fā)育異常，我們收集出生前后不同時期Dnmt3a-/-和野生型小鼠脊髓組織，通過RNA原位雜交檢測髓鞘相關(guān)基因Mbp和Plp1的表達(dá).如圖2和圖3，野生型小鼠脊髓組織分別于E14.5天和E16.5天開始檢測到Mbp(圖2 A)和Plp1(圖3 A)在腹側(cè)中線區(qū)域的表達(dá).隨著發(fā)育的進(jìn)行，Mbp+和Plp1+的少突膠質(zhì)細(xì)胞逐漸增多，主要分布在脊髓白質(zhì)區(qū)域.而在Dnmt3a-/-小鼠中，Mbp和Plp1的信號產(chǎn)生出現(xiàn)明顯滯后.E16.5期開始在腹側(cè)中線附近明確檢測到Mbp的表達(dá)(圖2 B’)，P0期左右在腹側(cè)白質(zhì)區(qū)域檢測到Plp1的表達(dá)(圖3 B’).隨后突變體中少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化沒有被抑制，細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，至P7天與野生型基本一致.進(jìn)一步對Plp1+細(xì)胞進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)Dnmt3a-/-小鼠中，Plp1+細(xì)胞數(shù)目的差異在OLs分化初期最明顯，隨著發(fā)育的進(jìn)行，這種差異逐漸縮小，至P10左右無明顯差異(圖3 E).通過對髓鞘相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)Dnmt3a基因敲除會延遲少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化.

A-D’：Mbp在野生型和Dnmt3a-/-小鼠中的表達(dá)分析.與野生型小鼠相比，突變小鼠中Mbp的表達(dá)在E14.5時被明顯抑制，E16.5開始有少量Mbp+細(xì)胞在腹側(cè)出現(xiàn)，P0至P7差異逐漸減小.

A-D’：Plp1在野生型和Dnmt3a-/-小鼠中的表達(dá)分析.與野生型小鼠相比，突變小鼠中Plp1的表達(dá)在E16.5時被明顯抑制，P0開始有少量Plp1+細(xì)胞在腹側(cè)出現(xiàn)，P3至P10差異逐漸減小. E:Plp1+細(xì)胞的數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果(n≥3,*P<0.05, ***P<0.005,n.s.:無顯著性差異).

2.3 Dnmt3a基因敲除對OPCs產(chǎn)生和增殖影響

考慮到Dnmt3a突變小鼠體內(nèi)OLs分化的延遲可能與OPCs的異常相關(guān)，我們進(jìn)一步檢測了不同時期OPCs 標(biāo)記基因Pdgfrα的表達(dá)情況.如圖4所示，在出生前E16.5時期，小鼠體內(nèi)已經(jīng)特化的OPCs發(fā)生迅速增殖(圖4 A).與野生型對照組相比，該時期Dnmt3a-/-小鼠體內(nèi)Pdgfrɑ+細(xì)胞的分布和數(shù)目無明顯差異(圖4 A’)，說明Dnmt3a基因敲除不影響早期OPCs的特化.P0時期，OPCs開始大量向OLs分化，Dnmt3a-/-小鼠體內(nèi)Pdgfrɑ+細(xì)胞數(shù)目顯著增加(圖4 B、B’)，至P7時期仍明顯多于野生型對照組(圖4 C、C’、D).因此，Dnmt3a基因敲除會造成分化階段OPCs數(shù)量增加，暗示可能與該階段OLs分化被延遲相關(guān).

3 討論

包括DNA甲基化在內(nèi)的表觀遺傳調(diào)控在少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程中的功能正在被逐漸揭示.其中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)在體內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和發(fā)育過程中的功能尚不清楚.本研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt3a早期在灰質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元中廣泛表達(dá)，從E14.5天開始在白質(zhì)內(nèi)表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸上升，當(dāng)OLs形成后表達(dá)消失，暗示DNMT3A可能參與調(diào)控OLs的起始分化.對Dnmt3a全局性敲除小鼠進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Dnmt3a基因敲除后，造成OLs分化的延遲，處于未分化狀態(tài)的OPCs數(shù)量增加.因此，我們的研究表明，DNMT3A的功能對于小鼠體內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞的正常發(fā)育是必需的.

A-C’: Pdgfra在野生型和Dnmt3a-/-小鼠中的表達(dá)分析.與野生型小鼠相比，突變小鼠中Pdgfra的表達(dá)在E16.5期無明顯差異，P0-P3期Pdgfra+細(xì)胞數(shù)目增多.D: Pdgfra+少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果(n≥3, *P<0.05, **P<0.01, n.s.:無顯著性差異).

然而，DNMT3A在體內(nèi)介導(dǎo)上述過程的分子機(jī)制尚不清楚.已有研究表明，通過對正常和Dnmt3a敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)譜分析，篩選到與少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的3個關(guān)鍵基因(Pdgfrα，Nkx2.2和Mbp)表達(dá)水平顯著上調(diào)，其近端啟動子區(qū)域高度去甲基化，暗示DNMT3A可能通過特異性誘導(dǎo)上述因子的甲基化，從而階段性調(diào)控OLs的分化[9].與Dnmt3a的表達(dá)類似，Nkx2.2在OLs譜系發(fā)育過程中具有階段性表達(dá)的特定，且兩者動態(tài)表達(dá)模式相吻合[11-12].我們的早期研究也已經(jīng)證實，敲除Nkx2.2也會造成OLs分化的延遲[13].綜上所述，我們初步推測，DNMT3A介導(dǎo)的DNA甲基化與NKX2.2之間可能存在緊密聯(lián)系，相互作用協(xié)調(diào)OPCs的增殖和分化.