吳怡青 趙崇軍 張文婷 趙霞 顧念念 孟雪丹 林瑞超 鄒迪新

摘要?目的：建立地龍藥材的真?zhèn)舞b別方法，為地龍藥材優(yōu)質(zhì)用藥提供新方法。方法：采用COI序列進(jìn)行分子生物學(xué)層面的基因序列分析，近紅外二級(jí)光譜判別建模分析進(jìn)行光譜學(xué)層面的分析，兩者共同鑒定地龍藥材的真?zhèn)?。結(jié)果：COI序列分析能夠鑒別地龍種屬，明確藥材的基源，近紅外建模分析結(jié)果與COI序列分析結(jié)果一致。結(jié)論：近紅外判別與COI基因分析結(jié)合能夠簡(jiǎn)便，全面的控制地龍藥材真實(shí)性，明確藥材基源。

關(guān)鍵詞?地龍;COI序列;近紅外建模;真?zhèn)舞b別;物種基源

Abstract?Objective：To establish the authenticity identification method of Dilong medicinal materials，and to provide new methods for high-quality medication of Dilong medicinal materials.Methods：The COI sequence was used to analyze the gene sequence at the molecular biology level，and the near-infrared secondary spectrum discrimination modeling analysis was used to analyze the spectroscopy level.The 2 jointly identified the authenticity of the Dilong medicinal materials.Results：COI sequence analysis can identify the species of Dilong，identify the source of the medicinal materials，and the results of near infrared modeling analysis are consistent with the results of COI sequence analysis.Conclusion：Mutual verification shows that the combination of the 2 can be simple and comprehensively control the authenticity of Dilong medicinal materials，clarify the source of medicinal materials.

Keywords?Dilong; COI sequence; Near infrared modeling; Authenticity identificat-ion; Species origin

中圖分類號(hào)：R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.006

地龍為常見的平肝熄風(fēng)類中藥，《中華人民共和國(guó)藥典》2015版規(guī)定：“蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥體稱之為廣地龍，通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）、櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥體稱為滬地龍”。動(dòng)物藥分子生物學(xué)鑒定的研究對(duì)象一般選擇線粒體基因[1]，其可作為遺傳信息的載體，用于研究動(dòng)物種群起源以及進(jìn)化。COI序列具有“變異少，易擴(kuò)增，且不易發(fā)生堿基缺失和插入”的特性，國(guó)際上，一般將其作為研究動(dòng)物類樣品的通用序列。本實(shí)驗(yàn)基于COI引物穩(wěn)定的特點(diǎn)，探究其對(duì)于地龍種屬鑒別的優(yōu)勢(shì)。建立地龍物種鑒別的分子生物學(xué)方法。同時(shí)基于近紅外光譜可應(yīng)用廣泛，可用于含氫基團(tuán)的檢測(cè)，同時(shí)具有簡(jiǎn)便、易操作的特性，根據(jù)其二維光譜分析結(jié)果建立的模型可用于藥材真?zhèn)纬醪借b別，可提高中藥研究人員的工作效率，采用2種方法對(duì)地龍藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，互相驗(yàn)證，共同保證藥材的基源真實(shí)性。

1?材料與方法

1.1?材料

實(shí)驗(yàn)試劑：瓊脂糖凝膠（Sigma-Aldrich，批號(hào)：102012071）;TAE buffer（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，批號(hào)：15558026）;Dneasy血液及組織核酸提取試劑盒（天根生化科技有限公司，批號(hào)：160024812）;無(wú)水乙醇（北京化工有限公司，批號(hào)：bh100488）;引物：HCO2198、LCO1490（北京議達(dá)成科技有限公司，批號(hào)：QPC2462-250）;Taq擴(kuò)增酶（美康儀器設(shè)備北京有限公司，批號(hào)：4398813）;DNA maker（北京博邁德基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：MD301-01）;無(wú)菌雙蒸水（上海源葉生物有限公司，批號(hào)：R21481）;核酸染料GeneGreen（天根生化科技有限公司，批號(hào)：R6628）;2號(hào)篩;40目篩（賽譜銳思北京科技有限公司，批號(hào)：YDS6）。電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，型號(hào)：MS105DU）;高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司，型號(hào)：FW-200型）;高速離心機(jī)（Thermo Fisher，型號(hào)：STRATOS）;電子恒溫水浴鍋（賽譜銳思北京科技有限公司，型號(hào)：SEP-1122-5）;格蘭仕微波爐（廣州格蘭仕微波生活電器制造公司，型號(hào)：G70D20CN1P-D2）;渦旋混合儀（天根生化科技北京有限公司，型號(hào)：OSE-VX-02）;高壓蒸汽滅菌鍋（Panasonic，型號(hào)：MLS-3751L-PC）;PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)艾本德公司Eppendorf AG，型號(hào)：eppendorf）;電泳槽、電泳儀（北京艾科儀器有限公司，型號(hào)：DYCP-31N型）;凝膠成像儀（英國(guó)伯樂(lè)公司BIO-RAD，型號(hào)：GeL Doc XR+）;近紅外光譜儀（美國(guó)尼高力有限公司，型號(hào)：A020FT-IR）;ContigExpress軟件、DNAman軟件、Editsep軟件、MEGA 6.0軟件、OMNIC軟件、SMICA軟件用于數(shù)據(jù)分析處理。本研究共收集地龍藥材及其混偽品共27批，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤君教授鑒定，其中S1-S12為市場(chǎng)上購(gòu)買，S14-S28為陜西步長(zhǎng)制藥有限公司提供，具體樣品信息見表1。

1.2?方法

1.2.1?COI序列分析

1.2.1.1?地龍組織中模板DNA的提取

取地龍藥材組織、洗凈、去除泥沙，挑選藥材組織中肌肉組織較多者為優(yōu)，采用DNA提取試劑盒上的規(guī)定方法進(jìn)行操作。具體步驟如下：1）剪取地龍藥材組織25 mg，以肌肉組織較多者為優(yōu)，放于1.5 mL離心管中，加入180 μL的Buffer ATL，20 μL的蛋白酶K，渦旋均勻，56 ℃下孵育直到其完全裂解。2）加入200 μL的Buffer AL，渦旋混勻。3）加入200 μL的無(wú)水乙醇，渦旋混勻（沉淀DNA）。4）吸取混合液過(guò)吸附柱后放置于2 mL的收集管中，8 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心半徑35 cm，離心時(shí)間為1 min，丟棄廢液。5）將吸附柱放于2 mL的收集管中，加入500 μL Buffer AW1，8 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心半徑35 cm，離心時(shí)間為1 min，丟棄廢液。6）將吸附柱放置于2 mL的收集管中，加入500 μL Buffer AW2，14 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心半徑10 cm，離心時(shí)間為3 min，丟棄廢液。7）將吸附柱轉(zhuǎn)移于新2 mL的離心管中。8）在吸附柱膜中心加入200 μL的Buffer AE洗脫DNA，室溫下孵育1 min，8 000 r/min的轉(zhuǎn)速，離心半徑35 cm，離心時(shí)間為1 min。9）將步驟8重復(fù)3次獲取地龍模板DNA。

1.2.1.2?PCR擴(kuò)增

COI正向引物HC02198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′;反向引物L(fēng)C01490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，將提取的地龍模板DNA經(jīng)COI的正反引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理，擴(kuò)增體系為50 μL，反應(yīng)體系見表2，PCR反應(yīng)條件見表3。

提取出來(lái)的地龍模板DNA經(jīng)過(guò)引物擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物是否產(chǎn)生以及供測(cè)序分析處理，需要進(jìn)行初步判定。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行跑膠處理后，觀察電泳條帶進(jìn)行分析，電泳儀的參數(shù)設(shè)置：電壓為140 V，電泳時(shí)間為25 min，擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜如圖1所示，條帶明亮清晰，可用于樣品的測(cè)序分析。

1.2.1.3?切膠純化測(cè)序

在紫外燈照射下觀察，選擇含有目的基因DNA片段中比較亮的條帶進(jìn)行切割，切割過(guò)程中要求盡量準(zhǔn)確，提高其回收率，上測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.1.4?地龍樣品序列的數(shù)據(jù)處理

測(cè)序結(jié)果經(jīng)ContigExpress軟件拼接并更改錯(cuò)誤堿基，剪除基因片段的引物區(qū)及低質(zhì)量部分，獲得長(zhǎng)度為580個(gè)堿基的樣品序列，修剪過(guò)的樣品序列經(jīng)BLAST檢索對(duì)比分析后根據(jù)相似匹配度大小獲得初步結(jié)論[2]。在BLAST上選取相似度最高、覆蓋度較大、得分較高的完整序列，用DNAman軟件將樣品序列和完整序列進(jìn)行多序列比對(duì)，選擇樣品序列中99%的序列，生成樣品序列的反向互補(bǔ)序列，用Editsep軟件將截取的樣品序列與由其生成的反向互補(bǔ)序列進(jìn)行合并，生成新的樣品序列，再次進(jìn)行BLAST檢索對(duì)比，得到最終結(jié)果。以MEGA 6.0軟件為分析平臺(tái)，構(gòu)建地龍樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。

1.2.2?近紅外建模分析

取過(guò)40目篩的地龍粉末均勻分布于樣品池中，將樣品池放置于近紅外光譜儀上，采集樣品原始光譜，波數(shù)范圍為12 000～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64次，每批樣品采集3份光譜圖，藥材共收集60份正品光譜，15份偽品光譜。樣品的近紅外數(shù)據(jù)分析需要取3份光譜的平均光譜，隨機(jī)抽取其中的48份正品光譜建立地龍近紅外光譜的鑒別模型，剩余正品和偽品則用作驗(yàn)證集，目的是為了評(píng)價(jià)所建立模型的準(zhǔn)確性和有效性。

2?結(jié)果

2.1?地龍COI分析

2.1.1?COI序列分析

收集市場(chǎng)上地龍藥材27批，正品22批，混偽品為5批，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后地龍種屬鑒別結(jié)果見表4，其中，S2、S3、S5、S8、S9、S10為參狀環(huán)毛蚓;S1、S6、S7、S14、S16、S17、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28為通俗環(huán)毛蚓，其余均為偽品。觀察物種鑒定分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)COI通用序列可以準(zhǔn)確鑒別地龍的種屬，為地龍的基源鑒別提供了科學(xué)的分子生物學(xué)鑒定方法。

2.1.2?COI序列多態(tài)性分析

地龍共有27條樣品序列，參狀環(huán)毛蚓6條樣品序列，經(jīng)DNAman軟件進(jìn)行多序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)共有6個(gè)單倍型，含有145個(gè)變異位點(diǎn)，一致性分析結(jié)果為73.49%，分析結(jié)果見圖2;通俗環(huán)毛蚓有16條樣品序列，每條樣品序列都存在不相似位點(diǎn)[3]，共有16個(gè)單倍型，經(jīng)軟件比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有135個(gè)變異位點(diǎn)，一致性分析結(jié)果為75.36%，分析結(jié)果見圖3;分析地龍樣品不同物種的種間變異情況，將27批地龍樣品序列導(dǎo)入DNAman軟件進(jìn)行多態(tài)性比對(duì)，種間變異一致性分析結(jié)果為66.87%，變異位點(diǎn)為192個(gè)，結(jié)果見圖4。綜上：地龍樣品的種內(nèi)變異一致性結(jié)果均大于種間變異，說(shuō)明此COI序列作為地龍物種的條形碼能夠很好的鑒別不同種屬的分布情況。

2.1.3?地龍遺傳鄰接系統(tǒng)聚類樹的建立

一般系統(tǒng)發(fā)育用于描述物種的起源和進(jìn)化情況，發(fā)育樹作為載體可以將其過(guò)程生動(dòng)形象的展現(xiàn)出來(lái)，進(jìn)化樹由結(jié)點(diǎn)和進(jìn)化分支組成，每個(gè)結(jié)點(diǎn)表示一個(gè)分類學(xué)單位，分支表示親代與后代的關(guān)系，分支長(zhǎng)度表示進(jìn)化過(guò)程的變化程度。通過(guò)鄰接法（N-J法）構(gòu)建的發(fā)育樹具有分析準(zhǔn)確，計(jì)算速度快，只得一棵樹的顯著優(yōu)勢(shì)?；贑OI序列擴(kuò)增的地龍樣品序列，經(jīng)N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖。見圖5。觀察建立的發(fā)育樹可得：通俗環(huán)毛蚓基本可成為獨(dú)立一支，其支持率為99%，而參狀環(huán)毛蚓與其他混偽品由同一結(jié)點(diǎn)，說(shuō)明其來(lái)源于同一祖先，可用于地龍各種屬之間的親緣關(guān)系的推測(cè)。綜上：COI序列可用于地龍正品、混偽品的鑒別，為該藥材的物種鑒定提供了新的分子生物學(xué)方法。

2.2?近紅外建模分析

2.2.1?正品與偽品近紅外光譜差異圖譜

以波數(shù)Wavenumber（cm-1）為橫坐標(biāo)，吸光度Absorbance為縱坐標(biāo)，在10 000～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)觀察地龍正偽品的近紅外光譜圖，正品地龍的近紅外原始光譜見圖6，偽品見圖7。用OMNIC軟件對(duì)地龍正品和偽品藥材的近紅外原始光譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在10 000～4 000 cm-1的近紅外光譜圖有明顯差異，吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2?光譜預(yù)處理

近紅外光譜包含了樣品的絕大多數(shù)的化學(xué)信息，光譜區(qū)的信息重疊嚴(yán)重，需要借助一定的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法和建模方法才可以進(jìn)行定性分析。近紅外光譜的原始光譜由樣品的真實(shí)化學(xué)信息投射光譜和不確定的背景吸收組成，同時(shí)中藥的成分眾多、組成復(fù)雜，因此很難從藥材的近紅外原始光譜中尋找特征吸收譜帶去進(jìn)行差異性分析，故需要對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，提取光譜中與待測(cè)量有關(guān)的信息，保證不同樣品間的信息差異能更好的體現(xiàn)。近紅外光譜的常見的預(yù)處理方式為：平滑處理和導(dǎo)數(shù)處理，平滑處理可以降低儀器的噪聲，提高信噪比;導(dǎo)數(shù)處理可以減少原始光譜的基線偏移和光譜偏移，其中，一階導(dǎo)數(shù)可以消除光譜中的扁平基線以減少光譜信息的不確定性，二階導(dǎo)數(shù)消除光譜中的傾斜基線，幫助在復(fù)雜的峰型中找到峰的準(zhǔn)確位置[4]。選擇的光譜預(yù)處理方法[5-6]為SNV（標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正）+Savitzky-Golay平滑模式（11點(diǎn)平滑）+二階導(dǎo)數(shù)的方式進(jìn)行光譜預(yù)處理，原始圖譜經(jīng)處理后得到的光譜。見圖8。

2.2.3?主成分分析

主成分分析的原理：將樣品中的影響變量進(jìn)行降維處理后獲得主要變量，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)的擬合或根據(jù)變量相似點(diǎn)進(jìn)行聚合[7]。將地龍藥材的原始近紅外光譜圖導(dǎo)入SMICA軟件中，經(jīng)光譜預(yù)處理后，進(jìn)行主成分分析，選取Q值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，共提取了2個(gè)主成分，主成分選擇情況。見圖9。主成分分析的3D得分圖。見圖10，其中：偽品S12單獨(dú)為一類，其余正品為一類，但存在異常樣本S15，其余樣本聚類情況明顯。主成分分析基本可以實(shí)現(xiàn)地龍藥材產(chǎn)地的溯源。

2.2.4?偏最小二乘法辨別分析

偏最小二乘法判別分析是通過(guò)測(cè)量傳感器陣列和由正確分類矢量組成的類關(guān)系矩陣提取數(shù)據(jù)并建立2種矩陣關(guān)系模型的有監(jiān)督模式識(shí)別[8]。多類判別分析法是一種集有效特征選擇與識(shí)別于一體的分析方法，應(yīng)用廣泛，主要是判別未知樣本應(yīng)該歸屬于哪一個(gè)已知總體[9]，首先根據(jù)已知樣本的多種觀測(cè)值建立判別函數(shù)，以此作為樣本劃歸為某一總體的依據(jù)，最后將判別樣品的有關(guān)數(shù)值代入判別函數(shù)，進(jìn)行該樣本的判別[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)10 000～4 000 cm-1波段的地龍近紅外光譜進(jìn)行光譜預(yù)處理后進(jìn)行偏最小二乘判別分析，提取前6個(gè)主成分，其累積貢獻(xiàn)率達(dá)到99%，可代表大部分光譜信息，圖11為偏最小二乘判別3D得分圖。模型判別混合矩陣見圖12，15批樣品歸1類為正品，3批樣品歸2類為偽品，剩余樣品作為驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，驗(yàn)證集混合矩陣結(jié)果見圖13，觀察數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)：S1、S2、S3為正品，S4為偽品，S11樣本為異常樣本，根據(jù)DNA條形碼發(fā)育樹分析，S11與正品藥材親緣關(guān)系較近。綜上所述，此判別模型可應(yīng)用于地龍藥材的真?zhèn)闻袆e，為藥材的初步鑒別提供一種鑒別方法。

3?討論

中藥材組成復(fù)雜且其質(zhì)量易受到產(chǎn)地，氣候，采集等多方面的影響。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)COI序列DNA條形碼技術(shù)對(duì)各批次藥材進(jìn)行品種鑒定，以保證樣品的準(zhǔn)確性和代表性。近紅外光譜作為一種二級(jí)分析方法，將近紅外光譜技術(shù)用于藥材鑒定方面常需要多種方法共同配合對(duì)原始近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行光譜預(yù)處理后進(jìn)行主成分分析，偏最小二乘辨別分析以及聚類分析3種建模方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種都可以用于評(píng)價(jià)地龍藥材的真?zhèn)?，但偏最小二乘辨別分析模型的準(zhǔn)確度由于主成分分析。由此可知：地龍的辨別分析模型可為地龍的真?zhèn)纬醪胶Y選提供新思路，新方法。同時(shí)為動(dòng)物藥的近紅外光譜分析建模提供相關(guān)的借鑒和參考。綜上所述：近紅外建模方法能夠?qū)Φ佚埶幉牡恼鎮(zhèn)舞b別進(jìn)行藥材的初級(jí)鑒別，簡(jiǎn)便快捷，COI序列分析可以從基因?qū)用鏈?zhǔn)確的鑒定藥材種屬，二者相互配合，互相驗(yàn)證，能夠很好的明確地龍藥材的基源，為動(dòng)物藥材的真?zhèn)舞b別提供新思路，新方法。

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（2020-06-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）