周施雨， 錢志萍， 曹東東， 於俊杰， 游蕤翔， 戴錫玲，①

(1. 上海師范大學(xué)： a. 生命科學(xué)學(xué)院， b. 環(huán)境與地理科學(xué)學(xué)院， 上海 200234； 2. 上海市第一人民醫(yī)院， 上海 200080)

近年來，蕨類植物的有效成分研究備受人們關(guān)注，藥用蕨類植物含有黃酮類、酚酸類、萜類、生物堿和多糖等化學(xué)成分[1]；其多糖除了參與構(gòu)成細(xì)胞壁和儲藏營養(yǎng)外，還具有提高免疫力、抗菌和抗癌的功效[2-3]。

陰地蕨〔Botrychiumternatum(Thunb.) Sw.〕隸屬于陰地蕨科(Botrychiaceae)陰地蕨屬(BotrychiumSw.)，為傳統(tǒng)藥用植物，全草入藥，具有清熱解毒、平肝息風(fēng)、止咳、止血和明目去翳的功效[4-5]。近年來，已有學(xué)者對陰地蕨中的黃酮類和酚酸類成分的生物活性進(jìn)行了研究[6-8]，但對于其多糖成分的生物活性尚缺乏全面的了解，僅曹劍鋒等[9]就陰地蕨多糖對小鼠結(jié)腸癌、紅白血病以及小鼠血液細(xì)胞等生物活性進(jìn)行了研究。

鑒于此，作者采用水提醇沉法從陰地蕨全草中提取粗多糖，并分析其抑菌和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，以期探明陰地蕨多糖成分的生物活性，為陰地蕨多糖的開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試陰地蕨全草于2016年12月采自湖北隨州，采集生長狀況良好的植株，晾干后切段，用粉碎機(jī)研磨成粉末，供試。大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)均由上海市第一人民醫(yī)院檢驗科提供；人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和人肺癌細(xì)胞(A-549)均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以及粗多糖提取和多糖含量測定 配制質(zhì)量濃度0.2 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液并進(jìn)行梯度稀釋，采用苯酚-硫酸法[10]測定波長490 nm處吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=21.552 0X-0.453 8(R2=0.963 3，線性范圍為5.840 0～58.380 0 μg·mL-1)。

稱取陰地蕨全草粉末20 g，采用水提醇沉法[11]提取粗多糖。將陰地蕨粗多糖配制成質(zhì)量濃度0.511 mg·mL-1待測溶液，同法測定波長490 nm處吸光度，并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

1.2.2 抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(MIC)測定 大腸桿菌菌液解凍后接種在無菌LB培養(yǎng)液中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌LB培養(yǎng)液稀釋成6×106CFU·mL-1菌液，待用。刮取金黃色葡萄球菌菌苔，接種在無菌TSB培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中加入適量的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.9%NaCl溶液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，用無菌TSB培養(yǎng)液稀釋至6×106CFU·mL-1菌液，待用。采用紙片擴(kuò)散法[12]分別制備含大腸桿菌和含金黃色葡萄球菌的平板。

配制質(zhì)量濃度分別為0.412、1.648和6.592 mg·mL-1的粗多糖無菌溶液，分別吸取20 μL滴于6塊平板的濾紙片上，并以質(zhì)量濃度相同的卡那霉素作為各自的陽性對照，以無菌超純水作為空白對照；將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并采用直尺(精度1 mm)測量抑菌圈直徑。實驗重復(fù)3次。

配制質(zhì)量濃度分別為0.103、0.206、0.309、0.412和0.515 mg·mL-1的粗多糖無菌溶液，采用上述方法觀察并測量抑菌圈直徑，確定MIC值[13]。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞相對存活率測定 配制含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%青霉素-鏈霉素的DEME培養(yǎng)液，并接種A-549和Hela細(xì)胞，然后置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、溫度37 ℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液并進(jìn)行傳代。分別取對數(shù)生長期的A-549和Hela細(xì)胞，按最佳鋪板密度接種100 μL細(xì)胞懸液至96孔培養(yǎng)板中，分別加入質(zhì)量濃度4.120、8.240、16.480、32.960和65.920 μg·mL-1粗多糖溶液，陽性對照組加入質(zhì)量濃度相同的喜樹堿，空白對照組不加粗多糖溶液，本底組不接種細(xì)胞；將培養(yǎng)板置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；然后每孔加入質(zhì)量濃度5 mg·mL-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入100 μL三聯(lián)液(包含體積分?jǐn)?shù)10%SDS、體積分?jǐn)?shù)5%異丁醇和0.01 mol·L-1HCl)，37 ℃培養(yǎng)過夜；培養(yǎng)結(jié)束后用全波長式微孔板酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)測定波長570 nm處吸光度(OD)，根據(jù)公式“相對存活率=〔(OD樣品組-OD本底組)/OD空白對照組〕×100%”計算各組腫瘤細(xì)胞的相對存活率。實驗重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

使用predict函數(shù)進(jìn)行點(diǎn)估計，取95%置信區(qū)間構(gòu)造區(qū)間估計，分別估算陰地蕨粗多糖對A-549和Hela細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)。采用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果和分析

2.1 陰地蕨全草的粗多糖得率及多糖含量

測定結(jié)果表明：陰地蕨全草的粗多糖得率為7.05%；粗多糖中多糖含量為20.60%，經(jīng)過換算可知陰地蕨全草的多糖含量為1.45%。

2.2 陰地蕨粗多糖的抑菌作用

不同質(zhì)量濃度陰地蕨粗多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑見表1。結(jié)果表明：陰地蕨粗多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，且對大腸桿菌的抑制作用略強(qiáng)于金黃色葡萄球菌；隨著粗多糖質(zhì)量濃度的提高，抑菌圈直徑均逐漸增大，表明陰地蕨粗多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用具有一定的濃度依賴性；當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度達(dá)到6.592 mg·mL-1時，抑菌作用最強(qiáng)。此外，陰地蕨粗多糖的抑菌作用明顯小于質(zhì)量濃度相同的卡那霉素(陽性對照)。

表1 陰地蕨粗多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑1)Table 1 Inhibitory zone diameter of crude polysaccharides from Botrychium ternatum (Thunb.) Sw. to Escherichia coli and Staphylococcus aureus1)

進(jìn)一步測定結(jié)果表明：陰地蕨粗多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為0.206和0.309 mg·mL-1，說明陰地蕨粗多糖對于大腸桿菌的抑制作用優(yōu)于金黃色葡萄球菌。

2.3 陰地蕨粗多糖對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

經(jīng)不同質(zhì)量濃度陰地蕨粗多糖處理后A-549和Hela細(xì)胞的相對存活率見表2。結(jié)果表明：隨著陰地蕨粗多糖質(zhì)量濃度的提高，A-549和Hela細(xì)胞的相對存活率均逐漸降低，當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度達(dá)到65.920 μg·mL-1時，A-549和Hela細(xì)胞的相對存活率分別為62.20%和65.80%，表明陰地蕨粗多糖質(zhì)量濃度越高，對A-549和Hela細(xì)胞增殖的抑制作用越強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。此外，陰地蕨粗多糖對A-549和Hela細(xì)胞增殖的抑制作用明顯小于質(zhì)量濃度相同的喜樹堿(陽性對照)。

表2 經(jīng)不同質(zhì)量濃度陰地蕨粗多糖處理后A-549和Hela細(xì)胞的相對存活率Table 2 Relative survival ratio of A-549 and Hela cells treated by crude polysaccharides from Botrychium ternatum (Thunb.) Sw. at different mass concentrations

predict函數(shù)計算結(jié)果顯示：陰地蕨粗多糖濃度與A-549和Hela細(xì)胞的相對存活率呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為Y=445.682 4-6.133 9X(R2=0.984 5)和Y=240.221 7-2.619 7X(R2=0.980 3)；陰地蕨粗多糖對A-549和Hela細(xì)胞的半抑制濃度分別為138.90和109.23 μg·mL-1。由此可知，陰地蕨粗多糖對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用略強(qiáng)于A-549細(xì)胞，且Hela細(xì)胞對陰地蕨粗多糖的濃度變化更敏感。

3 討論和結(jié)論

陰地蕨全草的多糖含量達(dá)1.45%，接近歐洲蕨〔Pteridiumaquilinum(Linn.) Kuhn〕全草的多糖含量，但高于烏蕨〔Stenolomachusana(Linn.) Ching〕、華南毛蕨〔Cyclosorusparasiticus(L.) Farwell.〕和井欄邊草(PterismultifidaPoir.)等蕨類植物全草的多糖含量[2]。烏蕨、蜈蚣蕨(PterisvittataLinn.)和華南毛蕨等蕨類植物的多糖對大腸桿菌、變形桿菌(Proteusvulgaris)和金黃色葡萄球菌均具有抑制作用[2]，而陰地蕨粗多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也有一定的抑制作用，說明蕨類植物多糖具有廣譜抗菌效果。陰地蕨粗多糖對大腸桿菌的抑制效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌，因而，可初步判斷陰地蕨粗多糖對革蘭氏陰性菌的抑制效果更強(qiáng)，這也佐證了陰地蕨對腸炎病原菌具有明顯的抑制效果[3]。陰地蕨粗多糖對A-549和Hela細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用；從半抑制濃度看，陰地蕨粗多糖對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于A-549細(xì)胞，且Hela細(xì)胞對陰地蕨粗多糖的濃度變化更敏感。

研究結(jié)果表明：陰地蕨粗多糖的抑菌和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，且均隨其質(zhì)量濃度提高而增強(qiáng)，但均明顯小于各自的陽性對照，說明雖然陰地蕨粗多糖呈現(xiàn)出一定的抑菌和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，但其藥用療效的開發(fā)有待更加科學(xué)深入的研究。