凌 巖， 秦 健， 尚旭嵐，b， 楊萬(wàn)霞，b， 方升佐，b，①

(南京林業(yè)大學(xué)： a. 林學(xué)院， b. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037)

青錢(qián)柳〔Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.〕隸屬于胡桃科(Juglandaceae)青錢(qián)柳屬(CyclocaryaIljinsk.)，又名青錢(qián)李、搖錢(qián)樹(shù)等，廣泛分布于中國(guó)廣西、四川和貴州等亞熱帶地區(qū)，是中國(guó)特有多功能樹(shù)種[1]。已有研究結(jié)果表明：青錢(qián)柳提取物具有多種生理活性，對(duì)人體健康有促進(jìn)作用，如抗氧化和防治“三高”等[2-3]。目前，關(guān)于青錢(qián)柳益于人體健康的機(jī)制尚未明確，但有研究發(fā)現(xiàn)青錢(qián)柳葉中多酚類(lèi)化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用[4]，且與總還原力、DPPH和ABTS自由基清除力呈顯著正相關(guān)關(guān)系[5]。酚類(lèi)化合物作為天然的抗氧化劑，對(duì)人體內(nèi)因氧化傷害引起的疾病具有延緩和抑制作用[6]。隨著產(chǎn)業(yè)化的逐步推進(jìn)，青錢(qián)柳受到越來(lái)越多的關(guān)注，但青錢(qián)柳的自然資源稀少，無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，因此，目前主要以發(fā)展青錢(qián)柳人工林為主，提高目標(biāo)產(chǎn)物的積累量。

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素之一，是蛋白質(zhì)、核酸和酶等結(jié)構(gòu)和功能大分子的重要組分[7]。研究發(fā)現(xiàn)，氮素的供應(yīng)水平不僅影響植物生長(zhǎng)，還對(duì)其體內(nèi)次生代謝物質(zhì)合成產(chǎn)生影響[8-9]。目前，有關(guān)施氮量對(duì)植物生長(zhǎng)和酚類(lèi)化合物含量的影響已有較多報(bào)道。Bénard等[10]對(duì)番茄(SolanumlycopersicumLinn.)分別施入12、6和4 mmol·L-1硝態(tài)氮時(shí)，其中4 mmol·L-1硝態(tài)氮處理的果實(shí)產(chǎn)量下降了7.5%，但酚類(lèi)物質(zhì)含量達(dá)到最高。Larbat等[11]認(rèn)為，低氮處理顯著提高番茄中3種酚類(lèi)單體的含量，但抑制莖的生長(zhǎng)。此外，不少研究還發(fā)現(xiàn)，氮素水平影響植物次生代謝物質(zhì)合成途徑關(guān)鍵酶的活性，并對(duì)其體內(nèi)次生代謝物質(zhì)的合成起調(diào)控作用[12-13]。作者所在課題組探討了氮素水平對(duì)浙江九畝村家系青錢(qián)柳苗期生長(zhǎng)及葉總酚含量的影響[14]，但施氮量對(duì)青錢(qián)柳不同器官總酚含量及積累量的影響尚不明確，尤其是施氮量對(duì)多酚合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響以及酶活性與總酚含量的關(guān)系。鑒于此，本研究以廣西金鐘山6號(hào)家系青錢(qián)柳為研究對(duì)象，研究不同施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗生長(zhǎng)和不同器官總酚含量及多酚合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響，探討青錢(qián)柳生長(zhǎng)與總酚積累量的關(guān)系，旨在為青錢(qián)柳人工林定向培育中合理施用氮肥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2014年10月采集廣西金鐘山6號(hào)家系青錢(qián)柳種子，參照Fang等[15]的方法進(jìn)行發(fā)芽處理，使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.2%赤霉素浸種1周后，在江蘇溧水白馬教學(xué)科研基地進(jìn)行層積催芽處理。2016年，待種子萌發(fā)后移至無(wú)紡布容器袋中培育，培育基質(zhì)配方為V(黃心土)∶V(珍珠巖)∶V(腐熟雞糞)∶V(草炭)=2∶2∶2∶4，基質(zhì)中有機(jī)碳、全氮、全磷和全鉀含量分別為43.65、7.35、2.98和9.89 g·kg-1，pH 6.7。于2017年5月選取生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗移至塑料盆(內(nèi)徑16 cm、高14 cm)中，每盆1株，在苗干基部進(jìn)行平茬處理，每盆裝入基質(zhì)1.13 kg，基質(zhì)配方為V(黃心土)∶V(珍珠巖)∶V(腐熟雞糞)∶V(草炭)=1∶1∶1∶7，基質(zhì)中有機(jī)碳、全氮、全磷和全鉀含量分別為82.18、3.77、2.60和9.43 g·kg-1，pH 6.44。在江蘇溧水白馬教學(xué)科研基地室外培育，自然光照，每日澆水，保持土壤濕潤(rùn)。平茬處理4周后，待株高15 cm時(shí)移至南京林業(yè)大學(xué)人工氣候室進(jìn)行室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 挑選生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的青錢(qián)柳幼苗進(jìn)行施氮量處理。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置每盆施氮量分別為0(CK，對(duì)照)、3(N1)和6(N2) g共3個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25株幼苗，共225株幼苗。施氮量以尿素〔陽(yáng)煤豐喜肥業(yè)(集團(tuán))有限責(zé)任公司，氮含量46%〕為準(zhǔn)，分別于處理0、30和60 d平均分3次施入。培養(yǎng)條件為光量子通量密度(PPFD)800 μmol·m-2·s-1、光照時(shí)間12 h·d-1、溫度(25±2) ℃和空氣相對(duì)濕度70%。

1.2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 處理90 d時(shí)，分別使用鋼卷尺(精度0.1 cm)和游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)測(cè)量所有青錢(qián)柳幼苗的株高和地徑；處理90 d時(shí)，每個(gè)處理根據(jù)株高和地徑平均值選取3株標(biāo)準(zhǔn)株，經(jīng)105 ℃殺青30 min后，在80 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)量單株根、莖和葉的干質(zhì)量，并計(jì)算單株總干質(zhì)量(單株根、莖和葉的干質(zhì)量之和)。將各處理的青錢(qián)柳根、莖和葉干樣研磨后過(guò)篩(孔徑100目)，用于全碳、全碳及總酚的含量測(cè)定。

1.2.3 全碳和全氮含量的測(cè)定 各處理分別稱(chēng)取100 mg青錢(qián)柳根、莖和葉干樣粉末，用錫箔紙包裹后，采用Elementar vario MACRO cube元素分析儀(德國(guó)Elementar公司)測(cè)定全碳和全氮的含量。不同器官的碳氮比為某器官中全碳含量與全氮含量的比值。

1.2.4 總酚含量的測(cè)定 各處理分別稱(chēng)取約2 g青錢(qián)柳根、莖、葉干樣粉末，參考岳喜良等[14]的方法去除樣品中雜質(zhì)，然后加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇20 mL，采用超聲波輔助提取法[16]于溫度70 ℃超聲(44 kHz，500 W)提取45 min，重復(fù)提取2次，合并2次提取液。待提取液揮干后，用甲醇反復(fù)清洗殘?jiān)⒍ㄈ葜?0 mL用于測(cè)定總酚含量。參照Alothman等[17]的方法測(cè)定總酚含量。單株不同器官總酚積累量根據(jù)公式“單株某器官總酚積累量=單株某器官干質(zhì)量×該器官總酚含量”進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 多酚合成途徑關(guān)鍵酶活性的測(cè)定 處理90 d時(shí)，稱(chēng)取0.2 g新鮮成熟功能葉(植株從上往下第3或第4枚葉)，用液氮充分研磨。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)的提取和活性測(cè)定參照Wang等[18]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析、多重比較(Duncan’s新復(fù)極差法)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗生長(zhǎng)的影響

施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗株高、地徑和干質(zhì)量的影響見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)：不同施氮量處理下，青錢(qián)柳幼苗的株高和地徑均在N1(每盆施氮量3 g)處理下最大，在N2(每盆施氮量6 g)處理下最小。與CK(每盆施氮量0 g，對(duì)照)處理相比，株高和地徑在N1處理下分別顯著增加了41.9%和14.8%；在N2處理下分別顯著減少了34.4%和16.9%。青錢(qián)柳幼苗單株的根、莖和葉干質(zhì)量以及總干質(zhì)量的變化趨勢(shì)與株高和地徑一致，均在N1處理下最大，在N2處理下最小。與對(duì)照相比，單株的根、莖和葉干質(zhì)量以及總干質(zhì)量在N1處理下分別顯著增加了46.1%、37.6%、42.8%和43.3%，在N2處理下分別顯著減少了48.3%、30.1%、63.8%和46.9%。方差分析結(jié)果表明：施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗株高、地徑以及不同器官干質(zhì)量均有顯著(P<0.05)影響。

表1 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗株高、地徑和干質(zhì)量的影響Table 1 Effect of applying amount of nitrogen on height， ground diameter， and dry mass of Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk. seedling

2.2 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗不同器官中全碳和全氮含量以及碳氮比的影響

施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗根、莖和葉中全碳和全氮含量以及碳氮比的影響見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)：隨著施氮量提高，根、莖和葉中全碳和全氮含量逐漸升高，碳氮比逐漸降低。與CK(每盆施氮量0 g，對(duì)照)處理相比，N1(每盆施氮量3 g)和N2(每盆施氮量6 g)處理下根和莖中全碳含量分別提高了4.7%和9.4%以及13.3%和16.1%，葉中全碳含量與對(duì)照無(wú)顯著差異；根、莖和葉中全氮含量分別顯著提高了80.0%和246.7%、28.9%和65.8%以及43.1%和77.8%；根、莖和葉中碳氮比分別顯著降低了41.9%和68.4%、12.1%和30.0%以及28.0%和41.4%。方差分析結(jié)果表明：施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗根和莖中全碳含量有顯著影響，對(duì)葉中全碳含量無(wú)顯著影響；對(duì)根、莖和葉中全氮含量和碳氮比有顯著(P<0.05)影響。

表2 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗不同器官中全碳和全氮含量以及碳氮比的影響Table 2 Effect of applying amount of nitrogen on contents of total carbon and total nitrogen and ratio of carbon to nitrogen in different organs of Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk. seedling

2.3 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗總酚積累的影響

2.3.1 對(duì)不同器官中總酚含量和積累量的影響 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗不同器官中總酚含量和單株不同器官總酚積累量的影響見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)：不同施氮量處理下，青錢(qián)柳幼苗根、莖和葉中總酚含量均在CK(每盆施氮量0 g，對(duì)照)處理下最高，在N1(每盆施氮量3 g)處理下最低。與對(duì)照相比，N1和N2(每盆施氮量6 g)處理下根中總酚含量分別顯著降低了44.8%和20.2%，莖中總酚含量分別顯著降低了56.8%和14.2%；葉中總酚含量在N1處理下顯著降低了53.6%，在N2處理下降低了9.6%，但差異不顯著。不同施氮量處理下各器官中總酚含量均為根中最高、葉中次之、莖中最低。方差分析結(jié)果表明：施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗不同器官中總酚含量有顯著(P<0.05)影響。

由表3還可見(jiàn)：與總酚含量相似，不同施氮量處理下，青錢(qián)柳幼苗單株根、莖和葉的總酚積累量以及總積累量總體上在對(duì)照下最高，在N2處理下最低。與對(duì)照相比，N1和N2處理下單株根、莖和葉的總酚積累量以及總積累量分別顯著降低了19.5%和58.8%、40.7%和40.2%、33.4%和67.2%以及26.4%和56.7%。不同施氮量處理下單株各器官總酚積累量均為根中最高、葉和莖中較低。方差分析結(jié)果表明：施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗單株不同器官的總酚積累量和總積累量均有顯著影響。

表3 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗不同器官中總酚含量和積累量的影響Table 3 Effect of applying amount of nitrogen on content and accumulation of total phenolics in different organs per plant of Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk. seedling

2.3.2 對(duì)葉中多酚合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗葉中多酚合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)：不同施氮量處理下，青錢(qián)柳幼苗葉中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)活性均在對(duì)照下最高，在N1處理下最低?？傮w上看，與對(duì)照相比，N1和N2處理下葉中PAL、C4H和4CL活性分別顯著降低了36.2%和21.9%、36.3%和21.3%以及49.6%和12.0%。方差分析結(jié)果表明：施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗葉中PAL、C4H和4CL活性有顯著影響。

表4 施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗葉中多酚合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響Table 4 Effect of applying amount of nitrogen on key enzyme activity in polyphenol synthesis pathway of leaf of Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk. seedling

2.4 青錢(qián)柳幼苗不同器官碳氮比與單株各器官總酚積累量的關(guān)系

青錢(qián)柳幼苗不同器官碳氮比與單株各器官總酚積累量的關(guān)系見(jiàn)圖1。結(jié)果(圖1)表明：青錢(qián)柳幼苗根和葉的碳氮比與其單株總酚積累量呈極顯著(P<0.01)線(xiàn)性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)0.93和0.99；莖的碳氮比與其單株總酚積累量呈顯著(P<0.05)線(xiàn)性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.74。

： 根Root; ： 莖Stem； : 葉Leaf.y1，y2，y3： 分別為單株根、莖和葉的總酚積累量Total phenolic accumulation in root， stem， and leaf per plant， respectively； x1，x2，x3： 分別為根、莖和葉的碳氮比Ratio of carbon to nitrogen of root， stem， and leaf per plant， respectively.圖1 青錢(qián)柳幼苗不同器官碳氮比與單株各器官總酚積累量的關(guān)系Fig. 1 Relationship of ratio of carbon to nitrogen in different organs of Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinsk. seedling with total phenolic accumulation in each organ per plant

3 討論和結(jié)論

氮素營(yíng)養(yǎng)條件是影響植物初生代謝和次生代謝的重要因子[19]。氮素的供應(yīng)水平不僅與植物的生長(zhǎng)速度及其各項(xiàng)生長(zhǎng)反應(yīng)特征密切相關(guān)，而且影響植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累[12，20]。閆娟[21]研究不同氮素供給水平對(duì)歐美107楊(Populus×euramericana‘74/76’)和中林46楊(Populus×euramericana‘Zhonglin-46’)生長(zhǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，施氮促進(jìn)二者整株葉面積顯著增加，并促進(jìn)了整株干質(zhì)量的積累。關(guān)佳莉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，隨著氮素濃度的增加，菘藍(lán)(IsatisindigoticaFortune)的葉和根干質(zhì)量逐漸增加。本研究中，施氮量對(duì)青錢(qián)柳幼苗的株高、地徑和干質(zhì)量均有顯著(P<0.05)影響，但隨著施氮量的提高，青錢(qián)柳的株高、地徑和干質(zhì)量呈先增加再減少的趨勢(shì)，可能由于青錢(qián)柳幼苗栽培基質(zhì)中所含氮素已達(dá)到其正常生長(zhǎng)所需量，隨著施氮量的提高，N2(每盆施氮量6 g)處理已超過(guò)其正常生長(zhǎng)所需氮素的臨界值，對(duì)苗木吸收其他營(yíng)養(yǎng)成分及光合作用產(chǎn)生影響，不利于苗木生長(zhǎng)。Li等[23]對(duì)墨西哥柏木(CupressuslusitanicaMill.)的研究發(fā)現(xiàn)，施氮量過(guò)高會(huì)顯著降低其葉中P、Ca和Mg含量，并顯著降低其光合能力，阻礙植物生長(zhǎng)。王力朋等[24]認(rèn)為，適量施用氮素能促進(jìn)楸樹(shù)(CatalpabungeiC. A. Mey)無(wú)性系的苗高、地徑和生物量，但過(guò)量施用氮素抑制楸樹(shù)無(wú)性系的生長(zhǎng)。段娜等[25]采用0～60 mmol·L-1氮素對(duì)白刺(NitrariatangutorumBobr.)進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)施用一定濃度范圍的氮素可促進(jìn)白刺株高、基徑和干質(zhì)量等的增加，但是氮素濃度過(guò)高不利于白刺苗木生長(zhǎng)。本研究中，CK(每盆施氮量0 g，對(duì)照)和N2處理下青錢(qián)柳幼苗不同器官中總酚含量均顯著高于N1(每盆施氮量3 g)處理，這可能是因?yàn)樵耘嗷|(zhì)中氮素含量過(guò)高或過(guò)低均會(huì)對(duì)青錢(qián)柳產(chǎn)生脅迫，青錢(qián)柳通過(guò)合成次生代謝物質(zhì)來(lái)緩解氮素脅迫。Ibrahim等[26]對(duì)卡琪花蒂瑪(LabisiapumilaBenth.)的研究結(jié)果也表明：低施氮量可以促進(jìn)卡琪花蒂瑪根、莖和葉中多酚的合成。Luo等[27]的研究結(jié)果也顯示：黑楊(PopulusnigraLinn.)葉中次生代謝物質(zhì)含量在施氮量過(guò)高的處理下顯著增加。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)等多酚合成途徑關(guān)鍵酶在多酚合成過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。Jenkins等[28]和Buer等[29]研究認(rèn)為，植物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)的合成部位是葉片。楊銀菊等[30]的研究結(jié)果顯示：煙草(NicotianatabacumLinn.)葉片的PAL和4CL活性均與多酚類(lèi)物質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致。劉冉等[31]也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)誘導(dǎo)紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)幼苗的PAL和C4H活性增加，多酚類(lèi)化合物積累量也會(huì)相應(yīng)增加。本研究中，青錢(qián)柳幼苗葉中PAL、C4H和4CL活性均與總酚含量呈相同的變化趨勢(shì)。

碳和氮代謝是植物體內(nèi)主要的2大基本代謝，與植物體內(nèi)的初生代謝和次生代謝途徑緊密相連[8，32]。一些假設(shè)提出，植物的生長(zhǎng)與次生代謝物質(zhì)合成之間存在不斷的競(jìng)爭(zhēng)[33-34]。本研究結(jié)果表明：N1處理下，青錢(qián)柳幼苗單株不同器官的干質(zhì)量均達(dá)到最大，但總酚含量均最低。這主要是因?yàn)橹参锏某跎痛紊x均是利用相同的營(yíng)養(yǎng)元素合成，主要以碳和氮為主[35]。植物通過(guò)體內(nèi)的碳氮平衡來(lái)調(diào)控初生代謝和次生代謝，而植物的碳氮比受其碳和氮吸收情況的影響[36]。本研究中，隨著施氮量的提高，青錢(qián)柳幼苗不同器官的全氮含量均顯著增加，碳氮比顯著降低。對(duì)葡萄(VitisviniferaLinn.)[37]和卡琪花蒂瑪[38]的研究結(jié)果也顯示：施氮水平與植株根系、莖和葉片中全氮含量呈顯著正相關(guān)，與碳氮比呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究中，青錢(qián)柳幼苗的生長(zhǎng)和總酚含量變化趨勢(shì)不一致，因此，需要在青錢(qián)柳生長(zhǎng)和次生代謝中尋找平衡，以期獲得目標(biāo)產(chǎn)物的最大積累量。青錢(qián)柳幼苗單株根、莖和葉的總酚積累量以及總積累量均在對(duì)照下達(dá)到最高，且不同器官中碳氮比與總酚積累量呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。對(duì)Brassicaoleraceavar.sabellicaLinn.[39]的研究也發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)碳氮比與以碳為基礎(chǔ)的次生代謝物質(zhì)含量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，青錢(qián)柳幼苗根、莖和葉的碳氮比與單株各對(duì)應(yīng)器官的總酚積累量呈顯著或極顯著線(xiàn)性正相關(guān)。由此可知，通過(guò)青錢(qián)柳體內(nèi)的碳氮比確定適宜施氮量，對(duì)獲得總酚的最大積累量具有重要意義。由于人工控制條件與野外環(huán)境條件存在較大的差異，如光照、土壤、溫度和水分等，因此，需要在野外環(huán)境對(duì)青錢(qián)柳進(jìn)行進(jìn)一步的研究。