mtDNA氧化損傷在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞高糖代謝記憶過程中的作用△

楊金波 謝琳

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者微血管病變的一種重要并發(fā)癥[1]，也是糖尿病患者視力下降和失明的主要原因[2-3]。由于DR發(fā)病率高、病情嚴(yán)重，其已成為我國(guó)盲癥防治的重點(diǎn)。對(duì)DR并發(fā)癥進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，患者組織存在一種特殊的代謝記憶現(xiàn)象[4]。這種現(xiàn)象是指患者經(jīng)歷一段時(shí)間的高血糖狀態(tài),即使血糖水平控制良好較長(zhǎng)時(shí)間后,血管并發(fā)癥仍然高發(fā)并進(jìn)展的現(xiàn)象。對(duì)于DR患者來說，高糖代謝記憶現(xiàn)象可能是血糖控制后病情繼續(xù)進(jìn)展的重要原因[4]。既往研究表明，DR患者視網(wǎng)膜血管存在mtDNA損傷，受損細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生過量活性氧自由基(ROS)，參與DR早期發(fā)病[5]。mtDNA一旦受損，將會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡增加,反過來又進(jìn)一步促進(jìn)ROS產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)[6-11]。由于代謝性記憶現(xiàn)象是DR過程中難以克服的現(xiàn)象，我們推測(cè)這種惡性循環(huán)會(huì)不斷促進(jìn)代謝性記憶過程發(fā)生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管mtDNA氧化損傷。

本研究我們利用人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(hRECs)體外模擬代謝記憶，將hRECs暴露于高糖環(huán)境中作用不同時(shí)間后再轉(zhuǎn)至正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，分別檢測(cè)hRECs mtDNA氧化損傷的變化及其對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞功能障礙的影響，進(jìn)而探討mtDNA氧化損傷在hRECs高糖代謝記憶過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組選擇生長(zhǎng)良好的第3～5代hRECs用于本實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前期對(duì)高糖作用hRECs的濃度篩選結(jié)果，選擇30 mmol·L-1葡萄糖作為作用濃度，含濃度為5.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基作為正常培養(yǎng)基。本研究將細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組對(duì)hRECs不做特殊處理，用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖誘導(dǎo)3 h組用高糖作用hRECs 3 h，高糖誘導(dǎo)12 h組用高糖作用12 h，高糖誘導(dǎo)24 h組用高糖作用24 h，之后均轉(zhuǎn)至正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d。

1.2 試劑與儀器hRECs細(xì)胞株(美國(guó)ATCC)，DMEM高糖和低糖培養(yǎng)基(中國(guó)Solarbio公司)，澳洲胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，ROS檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所)，凋亡試劑盒、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(日本TAKARA公司)，線粒體提取試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，細(xì)胞色素C單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，PCR儀7900HT FAST(美國(guó)ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hRECs細(xì)胞凋亡情況將各組細(xì)胞培養(yǎng)液吸出后用PBS沖洗1遍細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，輕輕吹打使貼壁細(xì)胞脫落，隨后1000 r·min-1離心5 min，棄上清收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞。取重懸的細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，之后再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，隨后置于冰浴中。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.2 Western blot檢測(cè)hRECs中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)提取hRECs總蛋白，常規(guī)定量和變性。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，加入一抗 4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗滌3次,37 ℃孵育二抗1 h，再次TBST洗滌3次，暗室添加ECL發(fā)光液孵育20 s，曝光拍照。以目的蛋白與GAPDH 蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)線粒體呼吸鏈復(fù)合物COX1 mRNA的表達(dá)提取 hRECs 總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以合成的 cDNA 作為模板在 ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增循環(huán)條件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用SYBR GREEN1嵌合熒光法在ABI 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。COX1引物：正向?yàn)?’-CCCCTCTTTCACCCACTTCC-3’，反向?yàn)?5’-CGCATGAGCATCTCTCGGAT-3’。以GADPH為內(nèi)參，引物:正向?yàn)?’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’,反向?yàn)?’-CGCCAGTAGACTCCACGAC-3’。樣本一式三份，采用2-ΔΔCt計(jì)算得出結(jié)果。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hRECs內(nèi)ROS含量用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌各組細(xì)胞，先激發(fā)20 min后各組原位裝載探針(按照11000無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA)，使得剛好蓋住細(xì)胞。將細(xì)胞放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針。收集細(xì)胞后，用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)與525 nm發(fā)射波長(zhǎng)，逐個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光強(qiáng)度。

1.3.5 ELISA法檢測(cè)hRECs線粒體內(nèi)mtDNA氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG含量將各組細(xì)胞棄培養(yǎng)液，PBS洗1遍后用胰蛋白酶消化，1000 r·min-1離心5 min后收集細(xì)胞。采用線粒體提取試劑盒提取線粒體。將每組線粒體樣本立即使用或置于-70 ℃保存。使用ELISA試劑盒檢測(cè)線粒體內(nèi)8-OHdG濃度。樣本一式三份，于酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)，記錄光密度(D)值，并繪制D值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)D值計(jì)算各組8-OHdG濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用 SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Games-Howell 法。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率mtDNA氧化損傷與凋亡密切相關(guān)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為6.94%。高糖誘導(dǎo)3 h組、12 h組及24 h組細(xì)胞凋亡率分別為10.30%、12.08%、13.55%；高糖誘導(dǎo)24 h組細(xì)胞凋亡率高于高糖誘導(dǎo)12 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，高糖誘導(dǎo)12 h組細(xì)胞凋亡率高于高糖誘導(dǎo)3 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況 A:對(duì)照組；B:高糖誘導(dǎo)3 h組; C:高糖誘導(dǎo)12 h組; D:高糖誘導(dǎo)24 h組

2.2 各組細(xì)胞中細(xì)胞色素C和COX1 mRNA的表達(dá)Western blot 結(jié)果顯示，各高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞線粒體氧化損傷相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；高糖誘導(dǎo)3 h組細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量低于高糖誘導(dǎo)12 h組和高糖誘導(dǎo)24 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見圖2。而高糖誘導(dǎo)3 h組COX1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于高糖誘導(dǎo)12 h組和高糖誘導(dǎo)24 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；各高糖誘導(dǎo)組COX1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見圖3。

圖2 各組細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量 A:對(duì)照組；B:高糖誘導(dǎo)3 h組;C:高糖誘導(dǎo)12 h組; D:高糖誘導(dǎo)24 h組

圖3 各組線粒體呼吸鏈復(fù)合物COX1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 A:對(duì)照組；B:高糖誘導(dǎo)3 h組; C:高糖誘導(dǎo)12 h組; D:高糖誘導(dǎo)24 h組。與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.3 各組細(xì)胞ROS含量各高糖誘導(dǎo)組細(xì)胞ROS含量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；高糖誘導(dǎo)3 h組ROS含量低于高糖誘導(dǎo)12 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高糖誘導(dǎo)12 h組ROS含量低于高糖誘導(dǎo)24 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即使hRECs轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，ROS的產(chǎn)生仍然不斷增加,說明代謝記憶現(xiàn)象存在。見圖4。ROS的生成隨時(shí)間逐漸增加，高糖誘導(dǎo)24 h組>高糖誘導(dǎo)12 h組>高糖誘導(dǎo)3 h組>對(duì)照組(均為P<0.05)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞ROS含量 A:對(duì)照組；B:高糖誘導(dǎo)3 h組; C:高糖誘導(dǎo)12 h組; D:高糖誘導(dǎo)24 h組

2.4 各組細(xì)胞mtDNA氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG含量各高糖誘導(dǎo)組線粒體氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG含量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；高糖誘導(dǎo)24 h組8-OHdG含量高于高糖誘導(dǎo)12 h組及高糖誘導(dǎo)3 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見表1。

3 討論

本研究結(jié)果表明，即使在細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常葡萄糖環(huán)境后，高糖誘導(dǎo)的hRECs線粒體氧化損傷仍然存在，mtDNA氧化損傷仍在繼續(xù)，細(xì)胞凋亡率和8-OHdG氧化應(yīng)激水平升高，ROS生成增加，提示hRECs mtDNA氧化損傷中存在高糖代謝記憶現(xiàn)象。

由于糖尿病患者長(zhǎng)期血糖控制依從性低，以及缺乏有效的早期干預(yù)藥物，晚期患者激光手術(shù)及外科手術(shù)效果不佳，因此了解DR發(fā)病機(jī)制的早期機(jī)制對(duì)制定有效的防治策略具有重要意義。DR是糖尿病患者視力下降和失明的主要原因，是糖尿病的一種重要的微血管并發(fā)癥[2]。它是一種進(jìn)行性疾病，可能從無癥狀的非增生性毛細(xì)血管無灌注、小動(dòng)脈瘤和視網(wǎng)膜出血，發(fā)展為視力威脅性疾病，如糖尿病性黃斑水腫和增生型DR[12]。以往的研究表明，高血糖和氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜血管損傷有關(guān)[13]，但是其確切機(jī)制尚不清楚。長(zhǎng)期血糖控制不良是血管并發(fā)癥發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一。盡管采用強(qiáng)化治療方案血糖控制良好，血管疾病仍可能發(fā)生并進(jìn)展，這種現(xiàn)象被稱為高糖代謝記憶[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，在良好控制血糖6個(gè)月后，凋亡的毛細(xì)血管細(xì)胞的數(shù)量較之前恢復(fù)良好，但仍繼續(xù)增加，這表明高糖下視網(wǎng)膜細(xì)胞也存在著代謝記憶現(xiàn)象[15]。我們的研究表明，hRECs同樣存在著代謝記憶現(xiàn)象，分別用高糖處理3 h、12 h、24 h，再轉(zhuǎn)至正常培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天后視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、mtDNA氧化損傷仍然持續(xù)存在。

高糖會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生過量ROS，從而導(dǎo)致血管損傷[16]。許多基礎(chǔ)研究表明，ROS過量產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是早期DR發(fā)病的主要因素[17]。高糖還會(huì)通過激活多元醇途徑形成晚期糖基化終末產(chǎn)物，激活蛋白激酶C 亞型，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[16]。ROS被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡的原因[18]，內(nèi)源性ROS主要產(chǎn)生在線粒體呼吸鏈上[19]。眾所周知，線粒體是細(xì)胞的能量來源，電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)或呼吸鏈負(fù)責(zé)ATP的產(chǎn)生。線粒體的另一個(gè)獨(dú)特特性是mtDNA，它不像細(xì)胞核DNA那樣被染色質(zhì)緊緊纏繞和壓縮，而是以一種相當(dāng)開放的構(gòu)象存在，使其特別容易受到破壞[20]。mtDNA編碼13個(gè)多肽，這些多肽都通過ETC參與氧化磷酸化。由于mtDNA與ETC接近，且缺乏組蛋白，它極易受到ROS介導(dǎo)的損傷[21]。mtDNA氧化損傷將會(huì)導(dǎo)致呼吸鏈線粒體蛋白、膜電位受損和ROS增加，導(dǎo)致惡性循環(huán)[5]。糖尿病發(fā)病過程中發(fā)生的代謝異?？纱碳ぞ€粒體ETC產(chǎn)生ROS。一旦高糖引起氧化應(yīng)激，線粒體受損將會(huì)導(dǎo)致ROS過量產(chǎn)生。即使控制了高糖，這些損傷仍在繼續(xù)[22]。

此外，在高血糖控制后，線粒體基因組編碼的DNA修復(fù)酶(包括糖基化酶)和其他蛋白在線粒體中的表達(dá)仍然低于正常水平。線粒體氧化應(yīng)激增加后，mtDNA和DNA修復(fù)系統(tǒng)的損傷在葡萄糖水平正?；笕灾辽俪掷m(xù)6個(gè)月[23]。在實(shí)驗(yàn)室條件下，即使在葡萄糖正常化后，人的視網(wǎng)膜細(xì)胞和視網(wǎng)膜周細(xì)胞仍繼續(xù)過量產(chǎn)生ROS[24]。這意味著線粒體異常是不可逆的，即使在高糖應(yīng)激結(jié)束后，這些受損的線粒體也是過量產(chǎn)生ROS的永久性來源。

在本實(shí)驗(yàn)中，體外模擬高糖代謝記憶產(chǎn)生條件，檢測(cè)hRECs mtDNA氧化損傷的變化及其對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞功能障礙的影響。我們發(fā)現(xiàn)hRECs暴露在高糖環(huán)境中3～24 h后，ROS的產(chǎn)生呈時(shí)間依賴性增加，線粒體呼吸鏈復(fù)合物COX1 mRNA表達(dá)下調(diào)，提示高糖可增加線粒體ROS的產(chǎn)生，損害線粒體呼吸功能。由于在細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常葡萄糖狀態(tài)后觀察到ROS產(chǎn)量的增加，所以ROS的不斷產(chǎn)生很可能是由于代謝記憶損傷線粒體呼吸鏈而產(chǎn)生的。我們的研究還從mtDNA氧化損傷角度明確了DR代謝記憶時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞暴露于高糖環(huán)境3 h后轉(zhuǎn)至正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，8-OHdG氧化應(yīng)激水平已經(jīng)開始升高，細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率增加，線粒體呼吸鏈亞基表達(dá)下降。

本研究表明，高糖下視網(wǎng)膜血管細(xì)胞存在著高糖代謝記憶現(xiàn)象，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞mtDNA氧化損傷可能是通過ROS的過量產(chǎn)生觸發(fā)代謝記憶，可能是“高糖損傷”解除后氧化損傷可持續(xù)存在的 “源動(dòng)力”。hRECs mtDNA氧化損傷是通過ROS的過量產(chǎn)生觸發(fā)代謝記憶，從而促進(jìn)DR的進(jìn)展，利用線粒體靶向技術(shù)保護(hù)線粒體不受代謝記憶的影響，確定阻止ROS產(chǎn)生惡性循環(huán)的最佳時(shí)間點(diǎn)，可能成為防治高糖代謝記憶的新方法。