響葉楊組培快繁技術(shù)研究

梁麗容，付 利，張國(guó)君，康偉靜，宋國(guó)寶，肖 毅

(泰格林紙集團(tuán)股份有限公司，湖南 岳陽(yáng) 414002)

響葉楊屬白楊派山楊類(lèi)，是我國(guó)特有的樹(shù)種，分布在我國(guó)南方10多個(gè)省(市、自治區(qū))的海拔300～2500m山地。響葉楊對(duì)土壤要求不嚴(yán)格，對(duì)土壤酸堿度的適應(yīng)性較強(qiáng)，黃壤、黃棕壤、沙壤土、沖積土、鈣質(zhì)土等酸性、微堿性土壤均能正常生長(zhǎng)。響葉楊木材白色，心材微紅，材質(zhì)和強(qiáng)度都較一般黑楊要好，可供房屋建筑、家具，造紙等用材，是長(zhǎng)江中下游海拔1000m以下山區(qū)土層深厚地方的重要造林樹(shù)種[1-5]。

響葉楊種子極小，外殼薄，易飛散，且成熟時(shí)間不一，采集難度大，所育苗木遺傳差異大，常規(guī)大田扦插繁殖又難以生根[6-8]，因此，組培快繁研究對(duì)響葉楊優(yōu)良無(wú)性系在南方山地的推廣有重要意義。響葉楊組培研究始于20世紀(jì)90年代，有學(xué)者先后對(duì)白楊、響葉楊的組培技術(shù)進(jìn)行了研究[9-11]，研究表明，白楊再生的最適外植體為葉片，愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+0.10mg·L-16 — BA+0.10mg·L-1NAA，愈傷組織誘導(dǎo)率為34.8%；不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+0.30mg·L-16 — BA+0.06mg·L-1NAA，不定芽分化率為44.4%；對(duì)響葉楊×84K楊高效再生體系建立的研究表明，莖段和葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+0.0015mg·L-1TDZ+0.05mg·L-1NAA，莖段不定芽再生率可達(dá)91%，誘導(dǎo)不定芽生根的最佳組合為1/2 MS+0.01mg·L-1NAA+0.10mg·L-1IBA，生根率可達(dá)100%。相關(guān)研究側(cè)重于培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比、篩選，實(shí)現(xiàn)離體再生目的，并未對(duì)響葉楊再生體系進(jìn)行優(yōu)化研究。以往研究成果，受制于外植體生存環(huán)境，工廠化快繁條件及操作人員水平，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中效果并不理想。

本文以響葉楊葉片為外植體，研究?jī)?yōu)化其再生體系，為響葉楊工廠化快速擴(kuò)繁提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 外植體的選擇及預(yù)處理

外植體來(lái)源為湖南茂源林業(yè)有限責(zé)任公司從湖北十堰市竹溪縣迷魂陣林場(chǎng)采摘回的響葉楊優(yōu)樹(shù)枝條，并將枝條上的芽苞嫁接到公司溫室栽培的黑楊苗干上進(jìn)行保存。3個(gè)月后將嫁接苗帶根植株移栽到培育室內(nèi)，每周用1000倍百菌清溶液噴灑植株，1個(gè)月后選取新發(fā)嫩葉做外植體。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 外植體消毒 用無(wú)菌水將外植體反復(fù)沖洗，時(shí)間20min，然后用濾紙吸凈后放置在干凈的工作臺(tái)上，使用0.10%升汞溶液進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別設(shè)計(jì)為4.5、5.5、6.5min，再用無(wú)菌水沖洗8次，最后用酒精焰火消毒后的無(wú)菌剪刀把傷口剪掉，在沒(méi)有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基環(huán)境中接種，每種處理接種60瓶，每瓶一個(gè)外植體，3次重復(fù)。經(jīng)過(guò)10d的培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)不同消毒時(shí)間外植體存活數(shù)量。

1.2.2 愈傷組織及不定芽誘導(dǎo) 10d后，將無(wú)菌外植體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽的培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)2種因素植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6 — BA(3種濃度水平分別為0.50、0.80、1.00mg·L-1)和NAA(3種濃度水平分別為0.10、0.15、0.20mg·L-1)的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)共9種處理(見(jiàn)表1)，每種處理接種30瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，重復(fù)3次。30d后按照同樣的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一次，50d后統(tǒng)計(jì)外植體誘導(dǎo)情況。

表1 不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)因素及水平Tab.1 Factors and levels of adventitious bud induction (mg·L-1)處理6-BA濃度NAA濃度1—10.500.101—20.500.151—30.500.201—40.800.101—50.800.151—60.800.201—71.000.101—81.000.151—91.000.20

1.2.3 增殖培養(yǎng) 50d后將已誘導(dǎo)出不定芽的芽團(tuán)轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)2種因素植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA(3種濃度水平分別為0.20、0.30、0.40mg·L-1)和NAA(3種濃度水平分別為0.10、0.15、0.20mg·L-1)的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)共9種處理(見(jiàn)表2)，每種處理接種30瓶，重復(fù)3次。30d后，對(duì)叢生芽生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。

表2 不定芽增殖試驗(yàn)因素及水平Tab.2 Factors and levels of adventitious bud proliferation test (mg·L-1)處理6-BA濃度NAA濃度2—10.200.102—20.200.152—30.200.202—40.300.102—50.300.152—60.300.202—70.400.102—80.400.152—90.400.20

1.2.4 生根培養(yǎng) 30d后，在生根培養(yǎng)基中接入挑選合格的不定芽，不定芽要求高2～3cm且生長(zhǎng)健壯。生根培養(yǎng)基以1/2 MS為培養(yǎng)基，采用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA(4種濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20mg·L-1)進(jìn)行處理，每種處理30瓶，重復(fù)3次。經(jīng)過(guò)20d培養(yǎng)后，對(duì)根數(shù)、根長(zhǎng)和生根率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 各階段基本培養(yǎng)條件 以上所有培養(yǎng)基均加入30g·L-1蔗糖；誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入5.20g·L-1瓊脂；增殖及生根培養(yǎng)基加入6.00g·L-1瓊脂；培養(yǎng)溫度為25±1℃；光照強(qiáng)度為5000～6000lx；光照周期為12h·d-1。

1.2.6 移栽 當(dāng)組培苗的根長(zhǎng)1～2cm，根數(shù)目5～7條時(shí)，進(jìn)行煉苗和移栽，將組培瓶移到自然光下閉瓶煉苗7d，待莖干變粗，葉片顏色加深、變厚后，然后再打開(kāi)瓶封煉苗3d。煉苗完成后用鑷子把組培生根苗取出，取清水沖洗干凈組培苗根部的培養(yǎng)基，然后放入1000倍多菌靈溶液浸泡10～20min，再移栽到基質(zhì)中。移栽苗床需采取遮蔭、保濕措施，保濕辦法采用全自動(dòng)噴霧系統(tǒng)，每10min噴水10s，每7d定期噴施2000倍多菌靈液預(yù)防病害，1個(gè)月后逐漸揭開(kāi)遮陽(yáng)網(wǎng)，增加光照強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

方差分析采用DPS 7.05，多重比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒時(shí)間比較

經(jīng)過(guò)不同消毒處理，外植體接種10d后，統(tǒng)計(jì)無(wú)菌外植體的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同消毒時(shí)間獲得無(wú)菌外植體統(tǒng)計(jì)Tab.3 The statistical table of the sterile explants obtained by different sterilization times消毒時(shí)間/min接種數(shù)/個(gè)污染數(shù)/個(gè)死亡數(shù)/個(gè)無(wú)菌數(shù)/個(gè)平均污染率/%平均死亡率/%平均無(wú)菌比/%4.56042±2 aA 4±1 aA14±2 a 70.0 6.723.35.56012±3 bB 6±1 aA42±3 bB20.0 10.0 70.0 6.560 6±1 cB30±3 bB24±3 cB10.0 50.0 40.0 注:方差分析結(jié)果同列數(shù)據(jù)小寫(xiě)字母表示在0.05水平上的差異顯著性;同列數(shù)據(jù)大寫(xiě)字表示在0.01水平上的差異顯著性。下同。

由表3可知，3種處理中，消毒時(shí)間5.5min處理效果最好，無(wú)菌外植體平均無(wú)菌比為70.0%，無(wú)菌數(shù)極顯著高于消毒時(shí)間4.5min處理，顯著高于消毒時(shí)間6.5min處理；消毒時(shí)間4.5min處理，滅菌時(shí)間不夠，平均污染率達(dá)到70.0%，污染數(shù)極顯著高于其它兩種處理；滅菌時(shí)間6.5min處理，因消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致外植體被殺死，平均死亡率達(dá)50.0%，死亡數(shù)極顯著高于其它兩種處理。

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的影響

在含不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA的MS培養(yǎng)基中，2周左右葉柄傷口膨大產(chǎn)生少量淺綠色愈傷組織，外植體體積比剛接種時(shí)增大1/3，在培養(yǎng)30d后產(chǎn)生少量再生芽，再轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)20d，累計(jì)培養(yǎng)50d后，外植體葉柄及葉脈處小芽增多，部分小芽長(zhǎng)達(dá)1.5cm，芽色嫩綠，可以看出葉柄及葉脈具有很強(qiáng)的再生能力。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA對(duì)不定芽誘導(dǎo)率因濃度而異，采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出不定芽誘導(dǎo)的最佳處理。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響葉楊不定芽誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The orthogonal test results of adventitious bud induction of Populus adenopoda Maxim處理6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)接種數(shù)/個(gè)分化數(shù)/個(gè)平均分化率/%誘導(dǎo)分化情況1—71.000.103027±2 aA90.0 葉片卷曲膨大,綠色,致密,傷口處不定芽多、粗壯1—81.000.153024±2 bAB80.0 葉片膨大卷曲,呈綠色、部分紅褐色,致密,不定芽多,較粗壯1—40.800.103024±2 bB80.0 葉片卷曲膨大,綠色,致密,不定芽分化較多1—50.800.153022±2 bcBC73.0 葉片卷曲膨大,綠色,致密,不定芽較多1—60.800.203021±1 cBC70.0 葉片卷曲膨大,綠色,疏松,不定芽分化較多,不定芽長(zhǎng)較多1—91.000.203020±1 cC67.0 葉片卷曲膨大,綠色,疏松,不定芽較多、小部分外植體枯黃1—10.500.103013±2 dD43.0 葉片卷曲膨大,綠黃色,部分紅褐色,部分外植體枯黃;誘導(dǎo)的叢生芽少,生長(zhǎng)慢1—30.500.203010±2 eDE33.0 葉片卷曲膨大,綠黃色,部分葉片枯黃,愈傷較多,不定芽長(zhǎng)勢(shì)弱1—20.500.1530 9±1 eE30.0 葉片卷曲膨大,綠黃色,部分外植體枯黃;誘導(dǎo)的叢生芽少,生長(zhǎng)慢

由表4可知，由于不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的影響，響葉楊葉片不定芽平均誘導(dǎo)分化差異非常明顯，最適合誘導(dǎo)和分化不定芽的培養(yǎng)基為處理1 — 7，方差分析顯示，其分化個(gè)數(shù)顯著高于處理1 — 1、處理1 — 2、處理1 — 3、處理1 — 4、處理1 — 5、處理1 — 6、處理1 — 8和處理1 — 9，極顯著高于除處理1 — 8之外的所有處理。

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽增殖培養(yǎng)的影響

在增殖培養(yǎng)基上將芽團(tuán)轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)一個(gè)月左右后，增殖芽在含不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表5。

由表5可見(jiàn)，當(dāng)芽團(tuán)接種于處理2 — 9，處理2 — 8處理2 — 7培養(yǎng)基時(shí)，不定芽平均增殖倍數(shù)為3.7～4.5。處理2 — 9植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA濃度為0.20mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)基增殖叢芽更多，增殖苗平均高度中等，芽團(tuán)基部產(chǎn)生較多的愈傷組織，增殖芽數(shù)方差分析表明，其增殖芽數(shù)顯著高于其他所有處理，極顯著高于除處理2 — 8之外的所有處理；處理2 — 8植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA濃度為0.15mg·L-1時(shí)，不定芽平均增殖倍數(shù)達(dá)4.0，增殖芽數(shù)方差分析顯示，其增殖芽數(shù)顯著高于處理2 — 1至2 — 6。

增殖苗高方差分析結(jié)果表明，處理2 — 7、處理2 — 8增殖苗高較除處理2 — 5之外的其它6種處理差異極顯著；處理2 — 5較處理2 — 9增殖苗高差異顯著，但未達(dá)極顯著水平，較處理2 — 1、2 — 2、2 — 3、2 — 4、2 — 6增殖苗高差異極顯著。

綜合平均增殖芽數(shù)和增殖苗高的情況，處理2 — 8雖然增殖芽數(shù)顯著低于處理2 — 9，但其增殖苗高極顯著高于處理2 — 9，且其增殖苗健壯，生長(zhǎng)旺盛，總體增殖效果更好。試驗(yàn)觀察到，當(dāng)溫度超過(guò)28℃，或是瓊脂濃度低于6.00g·kg-1時(shí)，增殖培養(yǎng)超過(guò)35d，組培苗容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

2.4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生根的影響

增殖苗在移入含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA的1/2 MS培養(yǎng)基10d左右后，無(wú)菌苗基部開(kāi)始長(zhǎng)出白色根點(diǎn)，隨著根的生長(zhǎng)，無(wú)菌苗進(jìn)一步生長(zhǎng)壯實(shí)。4種處理試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表6)顯示，1/2 MS+0.10mg·L-1NAA培養(yǎng)基處理的響葉楊生根率高達(dá)98.0%，生根數(shù)量最多，且根長(zhǎng)適中，移栽方便。

生根率方差分析顯示，0.10mg·L-1NAA培養(yǎng)基與0.20mg·L-1NAA培養(yǎng)基處理的生根率差異顯著，但未達(dá)極顯著水平，與0.05mg·L-1NAA培養(yǎng)基處理的生根率差異極顯著。

生根數(shù)方差分析顯示，0.10mg·L-1NAA培養(yǎng)基與0.20mg·L-1、0.05mg·L-1NAA培養(yǎng)基處理的生根數(shù)差異顯著，但未達(dá)極顯著水平；0.15mg·L-1、0.20mg·L-1、0.05mg·L-1NAA培養(yǎng)基處理的生根數(shù)相互之間差異不顯著。

根長(zhǎng)方差分析顯示，0.05mg·L-1NAA培養(yǎng)基處理較其它3種處理根長(zhǎng)差異極顯著；0.10mg·L-1、0.15mg·L-1NAA培養(yǎng)基處理根長(zhǎng)之間差異不顯著，2種培養(yǎng)基處理的根長(zhǎng)都較0.20mg·L-1NAA培養(yǎng)基處理差異顯著，但未達(dá)極顯著水平。

2.5 移栽效果

本次試驗(yàn)移栽所用的容器為塑料容器袋，塑料容器袋保濕性較好，但透氣、透水性不夠，易引發(fā)病害。試驗(yàn)采用了全自動(dòng)間歇噴霧系統(tǒng)，以保證移栽初期較高的葉面濕度。基質(zhì)配比為樹(shù)皮∶珍珠巖∶黃土=1∶1∶1，有利于多余的水分迅速排掉，防止移栽苗由于水份過(guò)多而腐爛。移栽2周后，每周使用1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液噴灑移栽苗一次，連續(xù)噴灑3～4周，一個(gè)月后可達(dá)92.0%的成活率。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)野外采集響葉楊枝條，再帶回研究地通過(guò)芽苞嫁接、溫室培育等預(yù)處理手段以獲得足夠多的試驗(yàn)材料。在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)開(kāi)展了響葉楊的外植體消毒、瓶?jī)?nèi)誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和移栽技術(shù)研究。相較于國(guó)內(nèi)其他研究人員開(kāi)展的白楊、響葉楊組培試驗(yàn)，本研究有如下獨(dú)特性：

(1)野外采集的外植體脫毒一直是組培技術(shù)的難點(diǎn)，不同于楊樹(shù)組培實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的外植體水培方法，本研究增加外植體芽苞嫁接、溫室培育等預(yù)處理手段，以減輕野外采集的外植體脫毒難度，同時(shí)有利于提供充足數(shù)量的試驗(yàn)用外植體。

(2)葉片誘導(dǎo)分化的適宜培養(yǎng)基為處理1 — 7(MS+1.00mg·L-16 — BA+0.10mg·L-1NAA)；在培養(yǎng)30d后產(chǎn)生少量分化芽，50d左右，分化芽增多，同時(shí)分化芽長(zhǎng)大。試驗(yàn)與朱忠榮等[12]研究的分化時(shí)間基本一致，但與其所用的WPM培養(yǎng)基配方不一致，根據(jù)其試驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)基配方為WPM+1.00mg·L-16 — BA+0.10mg·L-1NAA時(shí)，誘導(dǎo)葉面有突起，但無(wú)芽分化，適宜的配方為WPM+1.00mg·L-16 — BA+1.00mg·L-1NAA，可見(jiàn)在響葉楊外植體的誘導(dǎo)分化上，不同類(lèi)型基礎(chǔ)培養(yǎng)基能影響6 — BA與NAA的作用發(fā)揮；50d的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，在30d的時(shí)候進(jìn)行了一次轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，目的是防止外植體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足；處理2-8(MS+0.40mg·L-16 — BA+0.15mg·L-1NAA)為合適不定芽繼代培養(yǎng)基；1/2 MS+0.10mg·L-1NAA為適合的生根培養(yǎng)基。

(3)移栽苗床使用全自動(dòng)間歇噴霧系統(tǒng)，充分保證了移栽初期較高的葉面濕度，試驗(yàn)基質(zhì)選用樹(shù)皮∶珍珠巖:黃土=1∶1∶1，1個(gè)月后移栽成活率可達(dá)92%，比朱忠榮等[12]研究的火土∶田園∶腐熟肥=1∶1∶1基質(zhì)及人工澆水成活率要高12%。移栽成活率大幅提升，原因在于試驗(yàn)基質(zhì)中的樹(shù)皮和珍珠巖具有較高透氣性和瀝水性，組培苗不易發(fā)生病菌感染，使用全自動(dòng)間歇噴霧比人工澆水更能有效保障組培苗的水分維護(hù)。

(4)響葉楊繼代芽生長(zhǎng)速度很快，當(dāng)繼代培養(yǎng)溫度高于28℃時(shí)，組培苗玻璃化現(xiàn)象很容易出現(xiàn)。組培苗葉子卷曲變窄，綠色增厚，較像掃帚，有的會(huì)枯死。因此，在規(guī)模化生產(chǎn)時(shí)，增殖繼代培養(yǎng)要及時(shí)轉(zhuǎn)瓶，不僅能使培養(yǎng)空間有效利用，還能使芽的質(zhì)量得到保證。同時(shí)可以把增殖瓶放在培養(yǎng)室內(nèi)溫度相對(duì)低一點(diǎn)的地方進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的各階段要根據(jù)生長(zhǎng)情況，對(duì)瓊脂濃度進(jìn)行合理的調(diào)配。

(5)組培苗移栽前屬異養(yǎng)型生長(zhǎng)，生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)由培養(yǎng)基提供，瓶苗葉表面無(wú)蠟質(zhì)，葉孔處于打開(kāi)狀態(tài)，幾乎無(wú)木質(zhì)化，苗子脆弱，因此移栽前對(duì)瓶苗進(jìn)行煉苗非常重要，煉苗能使瓶苗逐漸適應(yīng)外部自然條件。組培苗移栽后非常容易失水萎蔫、死亡，移栽初期一定要做好定時(shí)噴霧保濕及遮蔭防曬工作。

(6)試驗(yàn)僅對(duì)響葉楊葉片組培技術(shù)進(jìn)行了研究，下一階段可進(jìn)一步對(duì)響葉楊莖段等其它部位的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究[13-15]，為響葉楊這一優(yōu)良山地楊樹(shù)的無(wú)性系繁殖及快速推廣提供技術(shù)支撐，并為未來(lái)響葉楊的分子遺傳育種打下技術(shù)基礎(chǔ)。