王 迪， 王 紅 英， 李 茂 琳， 張 宇， 徐 同

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人體在新陳代謝過程中會不斷產生自由基，而產生過多的自由基會造成諸多疾病，如神經系統(tǒng)損害、癌癥、糖尿病、炎癥、衰老等[1-3]?？寡趸瘎┚哂星宄杂苫淖饔?。研究表明，蒙藥材中含有諸多抗氧化活性物質，是天然抗氧化劑的重要來源[4-6]。蒙藥材各種抗氧化活性物質提取方面的研究已經取得很大的進展，但當前針對蒙藥材入藥方式方面的抗氧化活性物質的研究國內外還沒有相關報道。本研究針對蒙成藥劑最常用的兩種方法，即湯劑和酒劑[7]，對在治療腸道疾病、神經性疾病和尿路感染等疾病中具有顯著療效的13種蒙藥材進行水提和醇提，對提取液進行體外抗氧化活性比較。并使用大腸桿菌發(fā)酵液對不同提取液進行反應，比較反應前后抗氧化活性的變化，以期對13種蒙藥材提取物中的抗氧化活性成分和相關活性物質的生物轉化提供線索和依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

蓽茇、當歸、冬葵果、廣木香、沙參、漏蘆花、五靈脂、茜草、榧子、遠志、金蓮花、五味子、黃精，由內蒙古民族大學附屬醫(yī)院藥材科鑒定并銷售。使用時，對干燥藥材進行粉碎，制成60目粉末。

DPPH (1，1-二苯基-2-苦肼基自由基)，上海展云化工有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 醇提樣品的制備

準確稱取3 g粉碎后的13種蒙藥材，放入三角瓶中，分別加入90 mL 65%的乙醇，在室溫條件下，160 r/min搖床中浸泡12 h后過濾。將濾液按一定梯度濃度稀釋，備用。

1.2.2 水提樣品的制備

將粉碎后的13種蒙藥材放入三角瓶中，分別加入90 mL去離子水，煮沸3 h后冷卻、過濾，合并濾液，稀釋后備用。

1.2.3 大腸桿菌發(fā)酵液的制備

將冷凍保存的菌種在LB固體培養(yǎng)基上活化，取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃、200 r/min 的搖床中培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液離心取上清液備用。

1.2.4 大腸桿菌發(fā)酵液與提取物的反應

將醇提液和水提液進行旋轉蒸餾，剩余20 mL 時停止旋蒸，收集備用。分別取10 mL醇提液和水提液，加入離心后的大腸桿菌發(fā)酵液1 mL，室溫反應6 h，測定其抗氧化活性變化。

1.3 DPPH法測定提取樣品的抗氧化活性

在5 mL試管中依次加入配好的DPPH乙醇溶液2.5 mL和1 mL各組分質量濃度為33、3.3、0.33、0.033、0.003 3 mg/mL的醇提物和各組分質量濃度為33、16.5、8.25、4.125、2.012 5 mg/mL 的水提物，室溫下反應30 min，用酶標儀在517 nm處測定OD。同時測定2.5 mL DPPH乙醇溶液與1 mL乙醇混合后的OD和2.5 mL乙醇與各個質量濃度樣品的混合后的OD。按照公式計算不同濃度樣品DPPH的清除率(SR)，繪制標準曲線，得到樣品的IC50。

SR=(A0-Ai+Aj)/A0×100%

式中：A0為DPPH乙醇溶液與乙醇混合的OD；Ai為DPPH乙醇溶液與樣品混合的OD；Aj為乙醇溶液與樣品混合的OD。

1.4 羥自由基清除法測定提取樣品的抗氧化活性

在比色管中依次加入9 mmol/L的FeSO4和水楊酸各2 mL，質量濃度分別為33、3.3、0.33、0.033、0.003 3 mg/mL的醇提物和質量濃度為33、16.5、8.25、4.125、2.012 5 mg/mL的水提物2 mL和8.8 mmol/L的雙氧水溶液2 mL，混合后37 ℃水浴中反應30 min，用酶標儀在510 nm處測定OD。計算不同質量濃度樣品對羥自由基的清除率(R)。作標準曲線，求出IC50。

R=(A0-A2)/(A1-A2)×100%

式中：A0為樣品組OD，A1為以蒸餾水代替過氧化氫的對照組OD，A2為以蒸餾水代替樣品的空白對照OD。

1.5 大腸桿菌發(fā)酵液與蒙藥材提取物反應后抗氧化活性的測定

按步驟“1.3”測定提取液反應前后對DPPH的清除率。

2 結果與討論

2.1 13種蒙藥材醇提物和水提物的抗氧化活性

2.1.1 DPPH法比較醇提物和水提物的抗氧化活性

通過DPPH法測得蒙藥材醇提液的IC50如圖1所示，抗氧化能力由強到弱依次為五味子、遠志、金蓮花、廣木香、茜草、漏蘆花、當歸、蓽茇、五靈脂、沙參、黃精、榧子、冬葵果。

通過DPPH法測得蒙藥材水提液的IC50如圖2所示，抗氧化能力由強到弱依次為漏蘆花、金蓮花、五味子、五靈脂、廣木香、榧子、遠志、當歸、茜草、蓽茇、冬葵果、黃精、沙參。

圖1 DPPH法測定蒙藥材醇提物的抗氧化活性比較

圖2 DPPH法測定蒙藥材水提物的抗氧化活性

由圖1、2可知，五味子醇提液和水提液均具有較強的抗氧化活性，五味子中含有較多的木脂素和多糖，五味子中木脂素和多糖類可能是抗氧化活性物質的主要來源。對比了蔣軍輝等[9]對五味子抗氧化活性物質的研究(IC50=7.60 mg/mL)，本實驗使用的方法提取的抗氧化物活性更高(IC50=5.80 mg/mL)。漏蘆花、金蓮花水提物較醇提物具有更強的抗氧化活性。

2.2.2 羥自由基清除法測定醇提物和水提物抗氧化性

通過羥自由基清除法測得蒙藥材醇提液的IC50如圖3所示，其抗氧化能力由強到弱依次為五味子、當歸、金蓮花、榧子、遠志、黃精、廣木香、五靈脂、蓽茇、沙參、冬葵果、漏蘆花、茜草。

圖3 羥自由基清除法測定蒙藥材醇提物的抗氧化活性

通過羥自由基清除法測得蒙藥材的水提液的IC50如圖4所示，抗氧化能力由強到弱依次為漏蘆花、五味子、沙參、金蓮花、榧子、廣木香、冬葵果、當歸、蓽茇、遠志、五靈脂、茜草、黃精。

圖4 羥自由基清除法測定蒙藥材水提物的抗氧化活性

由圖3、4可知，五味子、金蓮花和榧子醇提物和水提物均對羥自由基有很強的清除作用。這與“2.1.1”中對五味子、金蓮花和榧子的抗氧化能力測定結果基本一致。通過比較不同提取液對羥自由基和DPPH自由基清除作用，發(fā)現榧子、金蓮花和五味子醇提物和水提物對DPPH和羥自由基均具有較強程度的清除作用。

2.4 大腸桿菌發(fā)酵液對13種蒙藥材提取液的作用

2.4.1 發(fā)酵液對醇提物的作用

將發(fā)酵液與蒙藥材醇提物進行反應，測定反應前后抗氧化活性的變化，如圖5所示。黃精、當歸、冬葵果和榧子醇提物在大腸桿菌發(fā)酵液反應后抗氧化性得到顯著提高，其中黃精、當歸和冬葵果尤為顯著，清除率分別提高了105.1%、97.1%和351.2%。

圖5 發(fā)酵液對蒙藥材醇提物的作用

2.4.2 發(fā)酵液對水提物的作用

將發(fā)酵液與蒙藥材水提物進行反應，測定反應前后抗氧化活性的變化，如圖6所示。蓽茇、遠志、五味子、黃精和沙參、冬葵果、廣木香活性在大腸桿菌發(fā)酵液反應后抗氧化性得到提高，其中蓽茇、冬葵果和沙參尤為顯著。其中蓽茇清除率提高近10倍，冬葵果、黃精、沙參清除率分別提高了77.5%、54.2%和149.7%。

圖6 發(fā)酵液對蒙藥材醇提物的影響

3 結 論

13種蒙藥材中，榧子、金蓮花和五味子對DPPH和羥自由基均表現出較高的清除作用；榧子、金蓮花和五味子水提物對DPPH清除的IC50分別為17.1、12.0、4.5 mg/mL，對羥自由基清除的IC50分別為31.1、12.5、13.1 mg/mL；醇提物對DPPH清除的IC50分別24.2、14.0、5.8 mg/mL，對羥自由基清除的IC50分別為27.0、24.2、15.3 mg/mL。與大腸桿菌發(fā)酵液反應后，黃精、榧子和當歸醇提物和水提物的抗氧化活性均得到顯著提高；黃精、當歸、冬葵果的醇提液和水提液對DPPH的清除率均有所提高。