馬 鎖， 叢 麗 娜， 謝 定 剛， 陳 清 平

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，在自然界中分布極為廣泛，它主要通過破壞肽聚糖的支架，使細菌細胞壁肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵水解，導致細胞裂解死亡，從而起到殺菌的作用[1]。溶菌酶廣泛存在于高等動物器官組織、分泌物以及部分植物體內(nèi)和微生物細胞內(nèi)[2-4]，具有抗菌消炎、抗病毒、增強免疫力等獨特功效，被廣泛應用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)[5-6]。i-型溶菌酶僅存于無脊椎動物中，在無脊椎動物先天免疫中起著重要作用[7-8]。與蛋清c型溶菌酶不同，水產(chǎn)動物i-型溶菌酶具有更廣泛的抗菌譜，即對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有明顯的抗菌作用[9]。目前工業(yè)提取溶菌酶的方法繁多復雜，因此，探索出成熟的i-型溶菌酶分離提純生產(chǎn)方法十分必要。

以本實驗室已構(gòu)建的能夠高效表達海參i-型溶菌酶的畢赤酵母基因工程菌HS 3-1為出發(fā)菌株，利用5 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，并對發(fā)酵液進行分離純化，制備出海參i-型溶菌酶；并對該溶菌酶進行pH、溫度和熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)及動力學模擬的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

畢赤酵母菌株為本實驗室已構(gòu)建的畢赤酵母基因工程菌HS 3-1；供試菌株為溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)均為本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物1 g，胰蛋白胨2 g，加水定容至90 mL，121 ℃滅菌20 min，待冷卻至50 ℃時，加入10 mL 10×葡萄糖。

BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物1 g，胰蛋白胨2 g，加水定容至70 mL，121 ℃滅菌20 min，待使用時加入10 mL 10%甘油，10 mL 10×YNB(含硫酸銨的酵母基礎氮源)以及10 mL磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0)。

BSM (1 L)培養(yǎng)基：85%磷酸26.7 mL，硫酸鈣0.93 g，硫酸鉀18.2 g，七水硫酸鎂14.9 g，氫氧化鉀4.13 g，甘油40 g，自來水定容至1 L，滅菌后加入PTM1 4.35 mL，發(fā)酵過程中pH用30%氨水調(diào)節(jié)。

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)酵罐種子液的制備

將活化后的畢赤酵母基因工程菌HS 3-1菌液，按1%的接種量接入YPD培養(yǎng)基，在30 ℃、180 r/min的條件下，搖床培養(yǎng)20～22 h。以1%接種量接入BMGY培養(yǎng)基，在30 ℃、220 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)14～16 h。

1.2.2 發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)

采用BSM基礎鹽培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速400 r/min，pH維持在6.0，按10%接種量接入種子液。發(fā)酵過程中，待基礎甘油耗盡后，向培養(yǎng)基中流加10%的甘油，流加時間約5 h，最終使酵母菌體濕重達到180～220 g/L；向發(fā)酵液中流加甲醇進行誘導發(fā)酵，利用甲醇檢測儀在線控制發(fā)酵液的甲醇體積分數(shù)為1.0%，誘導發(fā)酵時間為96 h。

1.2.3 發(fā)酵液分離純化

對發(fā)酵液進行離心，使用低溫冷凍離心機12 000 r/min離心10 min，收集上清液，該上清液經(jīng)過超濾濃縮儀進行初步的純化，收集截留液。通過鎳離子親和層析柱進一步純化，使用透析袋除去引入的鹽離子。使用真空冷凍干燥機對該透析液進行24 h冷凍干燥，制得海參i-型溶菌酶。

1.2.4 溶菌酶的特性分析

對制得的海參i-型溶菌酶產(chǎn)品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，確定目的蛋白的表達量和分離純度，進行抑菌性試驗，并利用MALDI-TOF測定相對分子質(zhì)量。

1.2.4.1 最適pH和最適溫度

測定溶菌酶在不同pH (4.0～9.0)及不同溫度(25～85 ℃)條件下的酶活力。酶活力單位定義：在一定條件下(25 ℃，pH 6.2)，450 nm處每分鐘吸光度下降0.001為一個酶活力單位(IU)。以溶壁微球菌粉為底物，通過分光度計進行測量[10]。

1.2.4.2 pH穩(wěn)定性和溫度的穩(wěn)定性

分別用pH 4.0～9.0磷酸鹽緩沖液配制1 mg/mL 溶菌酶液，處理10 min，再將pH調(diào)至7，以pH為7時作為對照，溶壁微球菌粉為底物，用比濁法測定溶菌酶液的相對酶活。用磷酸鹽(pH 6.2)緩沖液配制1 mg/mL溶菌酶液，分別置于65、70、75、80、85 ℃條件下水浴0～60 min，冷卻至室溫，以溶壁微球菌粉為底物，用比濁法測定溶菌酶液的相對酶活，實驗重復3次。

1.2.4.3 溫度對溶菌酶抑菌性的影響

用磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)配制1 mg/mL溶菌酶液，分別置于65、70、75、80、85 ℃條件下水浴10 min，冷卻至室溫，以溶壁微球菌為指示菌，用牛津杯法測定各個溶菌酶液的抑菌圈直徑，實驗重復3次。

1.2.5 分子動力學模擬

采用分子動力學模擬檢測不同溫度下酶的分子構(gòu)象變化。在分子動力學模擬過程中，通過SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫在線預測溶菌酶的初始結(jié)構(gòu)并生成相應的pdb文件[11]。使用程序生成具有平衡SPC水分子的立方體盒子，設定盒子邊長為6.598 0 nm，將溶菌酶放入盒子中，使用低溫退火程序在溫度為25、40、60、80 ℃下進行，步長為2 fs，總時間為10 ns。分子動力學模擬及結(jié)果分析均使用Gromacs 5.1.4軟件包完成[12-13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 海參i-型溶菌酶發(fā)酵結(jié)果

在5 L發(fā)酵罐中進行畢赤酵母基因工程菌HS3-1的發(fā)酵培養(yǎng)，每4 h取樣測定菌體濕重和酶活力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可看出，當發(fā)酵進行40 h左右，菌體濕重達到220 g/L，開始進行甲醇誘導，即溶菌酶開始產(chǎn)生，最后溶菌酶的最高酶活力達到600 U/mL。從圖2可以看出，目的條帶大約在14.3 ku附近，隨著甲醇誘導時間的延長，目的條帶越來越明顯，誘導至96 h的目的條帶最明顯。

M，Marker； 1～9，分別為誘導0、12、24、36、48、60、72、84、96 h的目的條帶

圖2 溶菌酶的SDS-PAGE結(jié)果

2.2 純化后溶菌酶性質(zhì)分析

經(jīng)過對發(fā)酵液離心、濃縮、過鎳離子親和層析柱和透析等蛋白純化過程，得到溶菌酶純化液，SDS-PAGE電泳和抑菌結(jié)果如圖3所示。由圖3(a)可以看出，純化后產(chǎn)物的雜蛋白基本除掉，得到電泳純的單帶，即產(chǎn)物的純度較高，可用于抑菌實驗。經(jīng)冷凍干燥后得到溶菌酶干粉，測定其對溶壁微球菌和銅綠假單胞菌的抑菌性，如圖3(b)所示，結(jié)果表明溶菌酶對溶壁微球菌有更好的抑菌活性。利用MALDI-TOF進行分析測定，如圖4所示，可以確定海參i-型溶菌酶的相對分子質(zhì)量為14 709。

(a) SDS-PAGE電泳圖

(b) 抑菌實驗

圖4 溶菌酶的質(zhì)譜圖

2.3 海參i-型溶菌酶特性

2.3.1 最適pH及穩(wěn)定性

海參i-型溶菌酶最適pH及穩(wěn)定性的測定如圖5所示。由圖5(a)可以看出，隨著pH的升高，酶活力也逐漸上升，pH達到6.5時，酶活力達到1 238 U/mL，可以得出溶菌酶的最適pH為6.5。由圖5(b)可看出，溶菌酶在pH 5.0～8.0有良好的穩(wěn)定性，相對酶活在80%以上。

2.3.2 溶菌酶最適溫度及其熱穩(wěn)定性測定

海參i-型溶菌酶最適溫度及熱穩(wěn)定性的測定如圖6所示。由圖6(a)可看出，當溶菌酶產(chǎn)品在溫度為35 ℃時，酶活力達到1 224 U/mL，可以得出溶菌酶的最適溫度為35 ℃。由圖6(b)看出，溶菌酶在溫度25～80 ℃有較好的熱穩(wěn)定性，仍保持80%的相對酶活力，超過85 ℃后相對酶活力迅速下降。這說明所制備的溶菌酶耐受較高的溫度范圍比較大，具有良好的熱穩(wěn)定性。

(a) 最適pH

(b) pH穩(wěn)定性

圖5 溶菌酶最適pH及pH穩(wěn)定性

Fig.5 Optimum and stability of pH of i-type lysozyme

(a) 最適溫度

(b) 熱穩(wěn)定性

2.3.3 分子動力學模擬溫度對溶菌酶蛋白質(zhì)構(gòu)象影響

為進一步探究溶菌酶的熱穩(wěn)定性，實驗設定在較高溫度條件下處理海參i-型溶菌酶，并檢測其抑菌活性(以抑菌圈直徑為指標)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，溶菌酶在65～85 ℃抑菌活性下降了27.8%，而作為對照的蛋清溶菌酶在相應溫度范圍內(nèi)抑菌活性下降了50%，這表明海參i-型溶菌酶具有更好的熱穩(wěn)定性。

表1 不同溫度處理后不同溶菌酶的抑菌性比較

為了深入研究海參i-型溶菌酶熱穩(wěn)定性變化的分子機理，利用分子動力學模擬來探究溫度對溶菌酶蛋白構(gòu)象的影響，分析該酶蛋白在不同溫度下的三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化，如圖7所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著模擬溫度的變化，溶菌酶蛋白的結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)一段“H1-L2-H2”(螺旋-環(huán)-螺旋)的構(gòu)象，而且從低溫(25 ℃)到高溫(80 ℃)處理過程中，中間的L2環(huán)發(fā)生了翻轉(zhuǎn)。但是在整個過程中，H1和H2兩個螺旋區(qū)域結(jié)構(gòu)基本沒有發(fā)生變化，并且通過分析比較確定了該酶的2個活性位點(Ser 18和His 48)分別位于“H1-L2-H2”構(gòu)象的2個螺旋區(qū)域。說明該溶菌酶三級結(jié)構(gòu)的“H1-L2-H2”構(gòu)象使其具有很強的抗菌活性，并且該酶又具有良好的熱穩(wěn)定性。模擬結(jié)果與實驗獲得的溶菌酶抗菌活性相吻合。Ibrahim等[14]對水蛭溶菌酶結(jié)構(gòu)的研究表明，其主要是單個螺旋肽形成的HLH起作用，與本實驗結(jié)果一致。

圖7 不同溫度處理后酶的構(gòu)象

3 結(jié) 論

利用畢赤酵母基因工程菌HS 3-1進行發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)生產(chǎn)海參i-型溶菌酶，經(jīng)分離純化、冷凍干燥得到溶菌酶產(chǎn)品。通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析確定了該溶菌酶的相對分子質(zhì)量為14 709。海參i-型溶菌酶最適溫度為35 ℃，最適pH為6.5，該酶在25～80 ℃有良好的穩(wěn)定性。分子動力學模擬也同時證明了該溶菌酶具有良好的熱穩(wěn)定性。分子動力學模擬蛋白構(gòu)象結(jié)果表明，該溶菌酶三級結(jié)構(gòu)的“H1-L2-H2”構(gòu)象是該溶菌酶分子能夠保持強抗菌活性和高度熱穩(wěn)定性的主要原因。