劉 堯， 劉 成 晟， 成 艷， 陳 明

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

二十二碳六烯酸(DHA)是一種重要的ω-3多不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)腦細(xì)胞發(fā)育、增強(qiáng)視力、預(yù)防和治療心腦血管疾病等生理功效[1]，被譽(yù)為新一代功能因子，廣泛用于食品醫(yī)藥行業(yè)。傳統(tǒng)的DHA主要來源于深海魚油，但魚油的品質(zhì)與產(chǎn)量難以滿足商業(yè)化發(fā)展需求。裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)是一種富含DHA的海洋真菌，具有生長速度快、易于培養(yǎng)、細(xì)胞內(nèi)油脂含量高等優(yōu)點，是商業(yè)化生產(chǎn)DHA的理想菌種之一，利用Schizochytriumsp.生產(chǎn)DHA已成為目前國內(nèi)外的研究熱點[2-3]。近年來，關(guān)于裂殖壺菌生產(chǎn)DHA油脂的報道更多地集中在發(fā)酵工藝和培養(yǎng)條件[4-5]，產(chǎn)量問題一直不理想。氮源對微生物菌體生長、油脂合成啟動、油脂產(chǎn)量和油脂組成等均產(chǎn)生重要影響[6-7]。本實驗利用一株Schizochytriumsp. DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂，研究了不同氮源對DHA油脂生成的調(diào)控作用，以期為微生物發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

Schizochytriumsp. DP-16，本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母浸粉10，蛋白胨2，海水晶15，pH 6.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80，酵母浸粉5，海水晶15，MgSO4·7H2O 5，KH2PO4·H2O 7；pH 6.0。

1.1.3 試劑與儀器

葡萄糖、MgSO4·7H2O，天津大茂化學(xué)試劑廠；酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；海水晶，山東強(qiáng)隆海水晶廠；KH2PO4·H2O，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氟化硼-甲醇，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

Agilent Technologies GC 7890氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 種子液制備

將甘油管接種于斜面后，在25 ℃條件下培養(yǎng)48 h，用接種環(huán)挑取4～5環(huán)接入裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

按10%的接種量將種子液接入裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在25 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h。

1.2.3 有機(jī)氮源對DHA油脂生成的影響

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加牛肉膏、玉米漿、蛋白胨、酵母浸粉4種有機(jī)氮源，添加量為5、10、15 g/L，測定油脂的產(chǎn)量。

1.2.4 添加谷氨酸鈉對DHA油脂生成的影響

分別添加谷氨酸鈉5、10、15 g/L，搖瓶發(fā)酵96 h，測定油脂的產(chǎn)量。

1.2.5 無機(jī)氮源對DHA油脂生成的影響

分別添加硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨3種無機(jī)氮源，添加量為0.5、1.0、1.5 g/L，搖瓶發(fā)酵96 h，測定油脂的產(chǎn)量。

1.2.6 分析方法

采用細(xì)胞干重法測生物量；采用磷酸香草醛法測油脂產(chǎn)量[8]；采用DNS法測定葡萄糖含量；采用靛酚藍(lán)分光光度法測溶氨含量[9]。

1.2.7 油脂總脂肪酸中DHA含量的測定

脂肪酸的甲酯化：在5 mL離心管中，加入發(fā)酵液1 mL和去離子水3 mL，8 000 r/min離心15 min，在離心后的沉淀中分兩次加入7 mL 1 mol/L氫氧化鈉-甲醇試劑，吸打沉淀完全后轉(zhuǎn)入50 mL磨口瓶，在70 ℃水浴條件下皂化反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)加入7 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在70 ℃水浴條件下發(fā)生甲酯化反應(yīng)30 min，反應(yīng)完畢后放置常溫下冷卻，繼續(xù)加入飽和氯化鈉10 mL 和正己烷試劑3 mL，搖勻后取上層有機(jī)相過膜用于氣相分析。

氣相色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱(5%苯甲基硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度260 ℃；FID檢測器，溫度280 ℃；載氣為氮氣，體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比1∶10；采取程序升溫：初始溫度140 ℃，維持5 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃，維持15 min。

根據(jù)脂肪酸各成分峰面積，采用峰面積歸一法計算DHA含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)氮源對DHA油脂生成的影響

不同種類的有機(jī)氮源對產(chǎn)油微生物的生長和發(fā)酵有著不同的作用[10]?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基分別添加質(zhì)量濃度5、10、15 g/L的牛肉膏、玉米漿、蛋白胨、酵母浸粉為有機(jī)氮源，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)96 h，對生物量和油脂產(chǎn)量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，以牛肉膏作為氮源時，油脂產(chǎn)量隨著氮源添加量的增加而下降。以玉米漿為氮源，隨著氮源添加量的增加，油脂產(chǎn)量先下降后回升，但產(chǎn)量均低于對照組，油脂產(chǎn)量整體偏低。以蛋白胨為氮源時，油脂產(chǎn)量先上升后下降。在4種氮源中，酵母浸粉促進(jìn)產(chǎn)油顯著，油脂產(chǎn)量整體偏高，添加量為15 g/L時，油脂產(chǎn)量最高，相比對照組提高了16.9%。

以牛肉膏和酵母浸粉為氮源時，隨著氮源濃度的增加，生物量不斷上升，酵母浸粉作為氮源添加時，生物量上升幅度達(dá)40%；玉米漿和蛋白胨為氮源時，生物量也出現(xiàn)過不同幅度的上升，氮源濃度高更傾向于促進(jìn)裂殖壺菌生物量的生成。結(jié)果表明通過有機(jī)氮源來調(diào)控裂殖壺菌等產(chǎn)油微生物產(chǎn)油是一種好的研究思路。

2.2 添加谷氨酸鈉對DHA油脂生成的影響

在添加15 g/L酵母浸粉條件下，分別添加5、10、15 g/L谷氨酸鈉，培養(yǎng)96 h，對生物量、油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在3種質(zhì)量濃度谷氨酸鈉添加條件下，油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比對照組分均有所提高。在添加谷氨酸鈉質(zhì)量濃度10 g/L條件下，油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為22.8 g/L和36.6%。添加谷氨酸鈉的生物量、油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對照組，說明谷氨酸鈉可以作為一種良好的外源添加劑促進(jìn)裂殖壺菌細(xì)胞生長和油脂發(fā)酵，且應(yīng)控制其添加質(zhì)量濃度。

2.3 無機(jī)氮源對DHA油脂生成的影響

陸向紅等[11]發(fā)現(xiàn)無機(jī)氮源對于產(chǎn)油微生物的生長和DHA油脂合成有作用，其中硝態(tài)氮和非硝態(tài)氮作用不同。謝辰等[12]發(fā)現(xiàn)以酵母浸粉為有機(jī)氮源，添加硝酸鈉，其菌體生物量、油脂產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量均達(dá)到最高。本實驗中，在添加10 g/L谷氨酸鈉條件下，分別添加0.5、1.0、1.5 g/L 硝酸鈉、硫酸銨和氯化銨，培養(yǎng)96 h，對生物量、油脂產(chǎn)量和DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。3種無機(jī)氮源中，實驗組的油脂產(chǎn)量均低于對照組。隨著氮源濃度的增加，硝酸鈉作為無機(jī)氮源時，DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先升高后下降趨勢，但均低于對照組；硫酸銨和氯化銨作為無機(jī)氮源時，DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷升高，1.5 g/L達(dá)到最大，高于對照組。

(a) ρ=5 g/L

(b) ρ=10 g/L

(c) ρ=15 g/L

在3種無機(jī)氮源中，硫酸銨和氯化銨都能提高DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，陳勝蘭等[13]發(fā)現(xiàn)添加硫酸銨能提高裂殖壺菌中不飽和脂肪酸的含量，與本實驗結(jié)果相符合。其中氯化銨作用最明顯，在質(zhì)量濃度1.5 g/L達(dá)到41.5%，比對照組提高了17.5%，其氣相譜圖如圖4所示。從圖4可以看出，DHA出峰時間在31.600 min。裂殖壺菌雖能利用一定濃度的無機(jī)氮源提高DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但不促進(jìn)產(chǎn)油。

圖2 不同谷氨酸鈉質(zhì)量濃度下DHA油脂的發(fā)酵情況

(a) ρ=0.5 g/L

(b) ρ=1.0 g/L

(c) ρ=1.5 g/L

圖4 1.5 g/L氯化銨條件下脂肪酸組成氣相峰譜圖

2.4 不同氮源種類和濃度下油脂發(fā)酵進(jìn)程的分析

取酵母浸粉15 g/L和谷氨酸鈉10 g/L復(fù)配，以初始氮源條件為對照組觀察油脂發(fā)酵進(jìn)程。每12 h取樣，對發(fā)酵過程中的生物量、油脂產(chǎn)量、殘?zhí)橇亢腿馨绷窟M(jìn)行測定，發(fā)酵96 h，結(jié)果如圖5所示。實驗組初始溶氨量比對照組高，氮源均在12 h被大量消耗。Ratledge等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)聪拇M時，產(chǎn)油微生物細(xì)胞內(nèi)積累的乙酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸合成途徑，油脂開始積累。從圖5(b)可以看出，12 h前主要以菌體生長為主，油脂產(chǎn)量較少；12 h后油脂開始加速積累，微生物繼續(xù)利用碳源，至96 h，葡萄糖基本耗盡，此時生物量和油脂量達(dá)到最大，分別為52和21.7 g/L。從圖5(a)可以看出，對照組的殘?zhí)橇枯^實驗組高，生物量和油脂量遠(yuǎn)低于實驗組。

3 結(jié) 論

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同種類和質(zhì)量濃度的有機(jī)氮源牛肉膏、玉米漿、蛋白胨和酵母浸粉，結(jié)果表明，酵母浸粉對于裂殖壺菌產(chǎn)油促進(jìn)明顯。谷氨酸鈉可以作為一種良好的外源添加劑。在3種無機(jī)氮源硝酸鈉、硫酸銨和氯化銨中，硫酸銨和氯化銨能提高DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，裂殖壺菌雖能利用一定濃度的無機(jī)氮源提高DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但不促進(jìn)產(chǎn)油。

(a) 對照組

(b) 實驗組

不同氮源種類和濃度下油脂發(fā)酵進(jìn)程結(jié)果表明，裂殖壺菌不斷消耗碳氮源用于細(xì)胞生長和油脂合成，在15 g/L酵母浸粉和10 g/L谷氨酸鈉氮源復(fù)配條件下發(fā)酵效果較好。