陶燕燕，梁國慶，蔡 偉，王曉靜，張 芯，牛秀瓏，陳少伯

0 引 言

舒洛地特是一種高純度多組分糖胺聚糖類藥物，其中移動(dòng)肝素即低分子肝素占80%，硫酸皮膚素占20%，主要適用于有血栓形成危險(xiǎn)的血管疾病[1-3]。已報(bào)道舒洛地特可通過抗氧化[4-5]、抗炎[5]、抗凋亡[6]等機(jī)制保護(hù)血管內(nèi)皮功能，目前已在糖尿病腎病[7]、血栓疾病和缺血再灌注損傷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，舒洛地特的主要成分——低分子肝素已經(jīng)在妊娠高血壓疾病的臨床預(yù)防性治療中表現(xiàn)出良好的有效性[8-9]。妊娠高血壓疾病的臨床類型包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發(fā)子癇前期以及慢性高血壓等[10]，其中約50%的妊娠期高血壓可在孕中晚期發(fā)展成子癇前期[11]，且引起血管內(nèi)皮損傷的相關(guān)促發(fā)因素于孕早期就已出現(xiàn)。基于上述，本研究擬用孕12周患者子癇前期血清(preeclampsia pregnant women serum,PES)干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以模擬孕期局部病理微環(huán)境，并觀察舒洛地特對(duì)PES干預(yù)下內(nèi)皮細(xì)胞增殖和管腔形成能力的調(diào)節(jié)作用，旨在為舒洛地特參與妊娠高血壓疾病的早期預(yù)防提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料收集2019年1月至6月武警部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科20份孕12周正常產(chǎn)婦血清(normal pregnant women serum, NPS)樣本和20份孕12周PES樣本，由本實(shí)驗(yàn)室生物樣本庫收集凍存。2組血清樣本內(nèi)皮功能相關(guān)因子的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為本實(shí)驗(yàn)室留種凍存，Ea.hy926人臍靜脈融合細(xì)胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司，舒洛地特(意大利阿爾法韋士曼制藥公司，2 mL:600 LSU/支)，DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、0.25% 胰蛋白酶(天津秀祥生物科技有限公司)，進(jìn)口胎牛血清(天津普瑞思生物科技有限公司，品牌ExCell Bio，貨號(hào)FND500)，CCK-8試劑盒(碧云天試劑，貨號(hào)C0038)，sFLT-1 ELISA kit和PlGF ELISA kit(天津普瑞思生物科技有限公司，品牌R&D，貨號(hào)DVR100C、DPG00)， Matrigel基質(zhì)膠(天津秀祥生物科技有限公司，品牌Corning，貨號(hào) 354234)。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：PJHEC-2015-A1)，研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)方法復(fù)蘇HUVEC和Ea.hy926細(xì)胞株，分別采用含10%進(jìn)口胎牛血清(FBS)的DMEM低糖和DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞具體生長情況換液或傳代，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。舒洛地特的溶解方式為：以等滲鹽水按比例配成0、1、3、10、30、100、300 LSU/mL工作液。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性HUVEC 和Ea.hy926細(xì)胞經(jīng)消化、計(jì)數(shù)，以每孔6000個(gè)鋪入96孔板中，培養(yǎng)4 h后更換為含5% FBS的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后換液，將舒洛地特按不同濃度分為7組，每組5復(fù)孔，各孔分別加入10 μL 不同濃度舒洛地特(或等體積對(duì)照溶劑等滲鹽水)和90 μL含5%FBS的培養(yǎng)基，使舒洛地特終濃度分別為：0、0.1、0.3、1、3、10、30 LSU/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL以無血清培養(yǎng)基稀釋10倍的CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h測(cè)定A450nm吸光度，參比波長A650nm。

1.2.3 Matrigel法檢測(cè)細(xì)胞管腔形成能力將分裝凍存的基質(zhì)膠提前置于4 ℃融化至液態(tài)，96孔板中每孔鋪膠50 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min以上，消化、計(jì)數(shù)細(xì)胞，以HUVEC每孔2×104個(gè)、Ea.hy926每孔4×104個(gè)、每孔100 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行鋪板，分為6組，每組3復(fù)孔，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h后換液，每孔加入10 μL不同濃度的舒洛地特(或?qū)φ杖軇┑葷B鹽水)和90 μL含10%FBS的新鮮培養(yǎng)基，使舒洛地特終濃度為：0、0.1、0.3、1、3、10 LSU/mL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后置于倒置顯微鏡40×或100×視野下，計(jì)數(shù)管腔形成數(shù)量。

1.2.4 Matrigel法檢測(cè)管腔形成能力按1.2.3所述融化基質(zhì)膠至液態(tài)，24孔板中每孔鋪膠250 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min以上； HUVEC每孔10×104個(gè)，Ea.hy926每孔20×104個(gè)， 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h后換液，按使用的不同病理生理血清和不同濃度舒洛地特干預(yù)將細(xì)胞分為7組：對(duì)照組(胎牛血清+NaCl)、NPS組(NPS+NaCl)、NPS+0.3 LSU/mL舒洛地特組、NPS+10 LSU/mL舒洛地特組、PES組(PES+NaCl)、PES+0.3 LSU/mL舒洛地特組、PES+10 LSU/mL舒洛地特組。每組3復(fù)孔，各孔分別加入50 μL 舒洛地特或等體積等滲鹽水和450 μL含10%病理或生理血清的新鮮培養(yǎng)基，拍板混勻，Matrigel法觀察管腔形成情況。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中sFLT-1和PlGF的分泌水平按1.2.4所述消化、計(jì)數(shù)、鋪板、分組及干預(yù)，NPS、PES及不同濃度舒洛地特干預(yù)6 h后每孔取細(xì)胞上清液300 μL，1500 r/min，離心5 min，離心半徑5 cm，將上清液分裝凍存于-70 ℃冰箱或立即參照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1(soluble fms-like tyrosine kinase receptor 1,s Flt-1)和胎盤生長因子(placental growth factor,PLGF)的分泌水平。

2 結(jié) 果

2.1 舒洛地特對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖影響CCK-8比色法結(jié)果顯示，在HUVEC細(xì)胞中，與0 LSU/mL吸光度比較，其他各濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.30)，提示舒洛地特不影響HUVEC細(xì)胞的增殖水平。但在Ea.hy926細(xì)胞中，與0 LSU/mL舒洛地特吸光度比較，10、30 LSU/mL 舒洛地特的吸光度明顯下降(P<0.05)，說明10 LSU/mL和30LSU/mL舒洛地特均可不同程度抑制細(xì)胞增殖。以上結(jié)果提示低濃度舒洛地特對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性無促進(jìn)作用，高濃度舒洛地特反而會(huì)抑制細(xì)胞增殖。見表1。

表 1 不同濃度舒洛地特對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

2.2 舒洛地特對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力影響0.1、0.3、1、3 LSU/mL舒洛地特均能促進(jìn)HUVEC細(xì)胞管腔形成。與0 LSU/mL舒洛地特管腔形成能力比較，0.3 LSU/mL舒洛地特促進(jìn)管腔形成作用顯著上調(diào)(P=0.00)，但當(dāng)舒洛地特濃度超過0.3 LSU/mL時(shí)，其促進(jìn)管腔形成作用逐漸下調(diào)，且10 LSU/mL舒洛地特促進(jìn)管腔形成作用最小(P=0.02)。在Ea.hy926融合細(xì)胞中，0.3LSU/ml 舒洛地特促進(jìn)管腔形成能力較0 LSU/mL顯著上調(diào)(P=0.001)，當(dāng)舒洛地特濃度繼續(xù)增大時(shí)其促進(jìn)管腔形成作用逐漸下調(diào)，10 LSU/mL舒洛地特對(duì)管腔形成能力無促進(jìn)作用(P=0.50)。見表2，圖1。

表 2 舒洛地特對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成數(shù)量的影響個(gè)/視野，n=6)

圖示0.3 LSU/mL舒洛地特促進(jìn)管腔形成作用顯著高于其他濃度

2.3 舒洛地特對(duì)PES誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力的保護(hù)作用在HUVEC細(xì)胞中，PES組管腔形成數(shù)量較NPS組、PES+0.3 LSU/mL舒洛地特組明顯降低(P<0.01)，較PES +10 LSU/mL舒洛地特組明顯升高(P<0.01)。在Ea.hy926細(xì)胞中，PES+0.3 LSU/mL舒洛地特組管腔形成數(shù)量較PES組明顯升高(P<0.01)；NPS+0.3 LSU/mL舒洛地特組較NPS組明顯升高(P<0.01)，NPS+10 LSU/mL舒洛地特組、PES組較NPS組明顯降低(P<0.01)。見表3。上述結(jié)果提示，PES可損傷內(nèi)皮細(xì)胞的成管活性，0.3 LSU/mL 舒洛地特可對(duì)PES誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞成管受損產(chǎn)生保護(hù)作用，但10 LSU/mL 舒洛地特則無此作用，且會(huì)加劇PES對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。見圖2。

表 3 舒洛地特對(duì)子癇前期病理血清誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成數(shù)量影響個(gè)/視野)

圖示0.3 LSU/mL舒洛地特可顯著上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力

2.4 舒洛地特對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞sFLT-1和PlGF的分泌影響在HUVEC、Ea.hy926細(xì)胞中，NPS+0.3 LSU/mL 舒洛地特組sFLT-1表達(dá)量較NPS組明顯降低(P<0.01)，PlGF表達(dá)量較NPS組明顯升高(P<0.01)；PES組sFLT-1表達(dá)量較NPS組、PES+0.3 LSU/mL舒洛地特組明顯升高(P<0.01)。在Ea.hy926融合細(xì)胞中，PES組PlGF表達(dá)量較PES+0.3 LSU/mL舒洛地特組明顯降低(P<0.01)。見表4。

表 4 舒洛地特對(duì)sFLT-1和PlGF的分泌水平影響

以上結(jié)果提示，子癇前期病理血清可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞sFLT-1的分泌、抑制PlGF的分泌，而0.3 LSU/mL 舒洛地特可改善子癇前期病理血清對(duì)sFLT-1的促分泌以及對(duì)PlGF的抑制分泌作用。

3 討 論

糖胺聚糖類藥物舒洛地特可保護(hù)內(nèi)皮功能，包括通過PI3K/Akt信號(hào)通路抵抗氧化應(yīng)激[12]，通過調(diào)控ET-1、VEGF等內(nèi)皮功能相關(guān)因子的分泌和凋亡等機(jī)制改善缺血缺氧[13]，通過抑制炎性因子/趨化因子的釋放抵抗內(nèi)皮損傷等[14]。研究證實(shí)舒洛地特的主要成分—低分子肝素能有效改善子癇前期，有助于防治子癇前期等病癥[15]。因此，本研究探討舒洛地特是否對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，以及是否能夠抵抗子癇前期病理血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成的損傷。

血管生成涉及內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移、管腔形成及血管生成相關(guān)因子的分泌等，其中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和管腔形成能力是細(xì)胞參與血管形成及維持血管形態(tài)的兩大重要特點(diǎn)[16]，本研究使用孕期生理和病理血清處理內(nèi)皮細(xì)胞，分別模擬正常孕期和子癇前期孕期胎盤微環(huán)境，結(jié)果表明低濃度舒洛地特對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性無顯著影響，而高濃度10 LSU/mL 舒洛地特能顯著抑制細(xì)胞增殖，說明低濃度舒洛地特對(duì)子癇前期無改善作用，高濃度舒洛地特反而會(huì)加劇子癇前期病情。但不同濃度舒洛地特對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力調(diào)節(jié)的效果不同，其中，0.3 LSU/mL 舒洛地特上調(diào)HUVEC和Ea.hy926細(xì)胞的管腔形成能力最強(qiáng)。與NPS相比，PES干預(yù)顯著下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力，說明子癇前期病理血清損傷內(nèi)皮細(xì)胞成管活性，也間接印證了子癇前期患者胎盤血氧供應(yīng)不足。0.3 LSU/mL 舒洛地特干預(yù)能顯著上調(diào)HUVEC和Ea.hy926細(xì)胞的管腔形成能力，在一定程度上逆轉(zhuǎn)PES帶來的病理損傷，說明0.3 LSU/mL 舒洛地特有助于改善子癇前期。本研究中0.3 LSU/mL 舒洛地特不調(diào)控增殖，但能改善管腔形成和胎盤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，因此舒洛地特可能通過干預(yù)管腔形成和胎盤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)途徑來調(diào)控血管生成，而并非通過調(diào)控增殖途徑。

sFLT-1主要由胎盤產(chǎn)生，能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合VEGF，抑制血管再生，影響胎盤血流供應(yīng)，子癇前期患者胎盤異常導(dǎo)致sFLT-1異常高表達(dá)，加劇了胎盤缺血。PlGF屬于VEGF家族，在胎盤局部表達(dá)，生物學(xué)功能為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、促進(jìn)血管新生，增加血管通透性。有研究表明子癇前期患者血清中sFLT-1表達(dá)上調(diào)，PlGF表達(dá)下調(diào)[17-18]，與正常妊娠者相比，有不良產(chǎn)科結(jié)局婦女的sFLT-1/PlGF比值顯著上調(diào)，并且在整個(gè)妊娠期間呈上升趨勢(shì)[19]，因此sFLT-1和PlGF的異常表達(dá)及兩者比值對(duì)子癇前期具有高度預(yù)測(cè)性。本研究結(jié)果表明，與正常孕婦血清相比，PES干預(yù)可上調(diào)sFLT-1以及下調(diào)PlGF的分泌水平，而0.3 LSU/mL 舒洛地特能顯著下調(diào)sFLT-1以及上調(diào)PlGF的分泌水平，逆轉(zhuǎn)子癇前期病理血清對(duì)sFLT-1和PlGF表達(dá)的調(diào)控，說明此濃度舒洛地特可顯著改善子癇前期孕期血清誘導(dǎo)的病理損傷。綜上所述，0.3 LSU/mL 舒洛地特可能通過調(diào)節(jié)sFLT-1/PlGF的分泌平衡改善子癇前期胎盤病理微環(huán)境。

目前雖舒洛地特在妊娠高血壓疾病防治方面的應(yīng)用報(bào)道較少，但本研究為其可能應(yīng)用于臨床提供了理論和數(shù)據(jù)支持，特別是低濃度(0.3 LSU/mL)的舒洛地特有望作為妊娠高血壓疾病防治的新選擇。但由于妊娠高血壓疾病患者血清樣本例數(shù)限制及患者的個(gè)體化差異，舒洛地特在改善妊娠高血壓疾病方面的應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究，其在應(yīng)用過程中的安全性也需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。