張賽南,施柳佳,廖志銀,王珍,王首鋒*
(1.浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系,浙江杭州310058; 2.綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司,浙江杭州310052)
自1928 年弗萊明爵士發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái),抗生素逐漸成為治療各種細(xì)菌感染或致病微生物感染類疾病的“特效藥”,大大提升了人類的健康生活質(zhì)量[1]。近年來(lái),由于抗生素的濫用加速了細(xì)菌的耐藥性,由此衍生出DNA 污染、超級(jí)細(xì)菌等一系列問(wèn)題[2]。溶菌酶(lysozyme,LYZ)最早由法國(guó)科學(xué)家尼克爾在枯草桿菌中發(fā)現(xiàn),其可有效溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的1-4 糖苷鍵,從而起到殺滅細(xì)菌的作用[3],是一種非特異性抗菌物質(zhì)。市售溶菌酶類產(chǎn)品主要用于殺菌防腐[4],且無(wú)毒副作用,具有傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑不可比擬的優(yōu)點(diǎn),廣泛用于各種食品[5]和飼料[6]中。
目前,市售的工業(yè)用蛋清溶菌酶(egg white lysozyme,EWL)主要通過(guò)化學(xué)方法從蛋清或蛋殼中提取,如鹽析法、離子交換層析法[7]、超濾法[8]等。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)和微生物表達(dá)技術(shù)的發(fā)展,通過(guò)微生物發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)重組溶菌酶,可以極大地降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有真核生物特有的生理體系,可對(duì)表達(dá)蛋白的加工、外分泌、翻譯后修飾以及糖基化等進(jìn)行調(diào)控,廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)[9]。多種類型的外源蛋白,如植物蛋白、動(dòng)物蛋白在畢赤酵母中獲得了成功表達(dá),大大提高了生物蛋白的利用度。同時(shí)對(duì)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化方法的相關(guān)報(bào)道也有不少[10-11]。
本文選用巴斯德畢赤酵母作為表達(dá)菌株,并通過(guò)蛋清溶菌酶密碼子優(yōu)化這一途徑來(lái)獲得高表達(dá)蛋清溶菌酶的重組酵母菌,對(duì)蛋清溶菌酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)以及應(yīng)用推廣具有重要意義。
1.1.1 菌株和載體
藤黃微球菌(ATCC4698)購(gòu)于美國(guó)Sigmam 公司,真核表達(dá)載體pPIC9K、畢赤酵母菌株GS115、大腸桿菌Top10、BL21 均為實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2 試劑與工具酶
In-fusion clone 試劑盒(Clontech 公司生產(chǎn))、高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase)、限制性內(nèi)切酶NotI、EcoRI、SnaBI、SalI 均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于Axygen 公司;Bradford 蛋白定量試劑盒購(gòu)于BIOMIGA 公司。Ampicillin、Kanamycin 和 G418 硫酸鹽均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋清溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品和葡聚糖凝膠柱Sephadex G-50 購(gòu)于美國(guó)Sigmam 公司;強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換柱SPSepharose FF 購(gòu) 于 Amersham公司。HD-3000 型電腦核酸蛋白檢測(cè)儀購(gòu)于上海嘉鵬科技有限公司。
1.1.3 菌株培養(yǎng)基
大腸桿菌-LB 培養(yǎng)基,酵母-YPD 培養(yǎng)基,發(fā)酵表達(dá)-BMMY、BMGY 培養(yǎng)基,具體的配制以及培養(yǎng)方法參見(jiàn)畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體試劑盒說(shuō)明書。
1.1.4 引 物
特異性引物:
通用引物:
1.2.1 蛋清溶菌酶基因的密碼子優(yōu)化及重組表達(dá)載體的構(gòu)建
從美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)下載蛋清溶菌酶基因(Gene ID: 396218)的開放閱讀框區(qū)段,在http://www.jcat.de/網(wǎng)站上選取酵母屬作為表達(dá)菌株,替換該基因片段的個(gè)別密碼子[12],目的基因序列的合成交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。通過(guò)設(shè)計(jì)與表達(dá)載體pPIC9K 具有同源區(qū)段的特異性引物,以coEWL為模板,在 95 ℃、3 min,95 ℃、30 s,68 ℃、10 s,72 ℃、30 s,30 個(gè)循環(huán)的 PCR反應(yīng)條件下,高保真擴(kuò)增出帶同源臂的coEWL基因的ORF 區(qū)段。在In-fusion clone 酶作用下將其克隆到pPIC9K 中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-coEWL(見(jiàn)圖1)。
在42℃條件下,將重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞中。用Kan+Amp 雙抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒抽提后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,檢驗(yàn)其構(gòu)建是否正確。具體操作參見(jiàn)畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體試劑盒說(shuō)明書。
圖1 重組表達(dá)載體pPIC9K-coEWL 的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant expression vector pPIC9K-coEWL
1.2.2 電轉(zhuǎn)化、高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定
選用SalI 酶切測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pPIC9K-coEWL,獲得線性質(zhì)粒,利用同源重組將其整合至酵母基因組中。取OD600(酵母菌體在600 nm 處的光密度)為1.2 左右的酵母菌體20 mL,在8 mL混合溶液(10 mmol·L-1Tris-HCl, pH6.0,10 mmol·L-1LiAc, 0.6 mol·L-1山梨醇, 10 mmol·L-1DTT)中室溫靜置 30 min[13];4 ℃ 2 000 r·min-1離心,收集沉淀,用 1 mol·L-1山梨醇溶液清洗 3 次,最后添加 1 mol·L-1山梨醇溶液溶解 80 μL,制得酵母感受態(tài)細(xì)胞。取約10 ng 線性質(zhì)粒與酵母感受態(tài)細(xì)胞混合,1.5 kV 電擊后立即添加800 μL 山梨醇溶液,復(fù)蘇1 h,涂布MD 平板,初步篩選His+轉(zhuǎn)化子。
用無(wú)菌水沖洗MD 平板上生長(zhǎng)的酵母菌落,將菌液稀釋 104倍 ,并涂 布于梯度 G418(1~15 mg·mL-1)-YPD 平板上,選擇高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)良好的酵母轉(zhuǎn)化子,放于單克隆YPD培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),取200 μL 培養(yǎng)液離心,棄上清液,滅菌后用 ddH2O 清洗,沉淀 3 次,最后添加 50 μL無(wú)菌水混勻。取1 μL 上清作為菌落PCR 的模板,以α-Factor 和 3'AOX1序列作為引物 ,PCR 條 件 為95 ℃ 、5 min,95 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、2 min,30 個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠鑒定PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。
1.2.3 重組酵母G-p-coEWL的誘導(dǎo)表達(dá)
挑選陽(yáng)性酵母重組子(G-p-coEWL)單菌落,接種于 50 mL BMGY 培養(yǎng)基中,28 ℃,240 r·min-1培養(yǎng)18 h,離心后獲得沉淀菌體。選取適量菌體,重懸于250 mL BMMY 培養(yǎng)基中,使菌液起始OD600在1.0 左右,相同條件下培養(yǎng)96 h。期間每隔12 h 取出5 mL 發(fā)酵液作為分析樣品,立即離心棄菌體,保留上清液,于-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)向培養(yǎng)基添加適量體積無(wú)水甲醇,且維持甲醇濃度為0.5%。
1.2.4 表達(dá)蛋白的定性分析與酶活檢測(cè)
取1 mL 上清液,用三氯乙酸(TCA)脫鹽處理,然后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。首先在樣品中添加上清0.11 mL 的TCA 溶液,混勻于-20 ℃過(guò)夜,冷丙酮清洗沉淀,晾干加水溶解沉淀,添加上清緩沖液,98 ℃、5 min,即得電泳上樣樣品。配置15%分離膠以及5%濃縮膠,20A/板進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,考馬斯亮藍(lán)染液染色,乙酸脫色液脫色,觀察蛋白電泳結(jié)果。
Bradford 法測(cè)定發(fā)酵上清液中總蛋白濃度,配置牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定微球菌在595 nm 處的吸光度(A595)并繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)曲線計(jì)算發(fā)酵液蛋白量,詳細(xì)操作步驟參見(jiàn)TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 使用說(shuō)明書。
采用比濁法[14]測(cè)定蛋清溶菌酶的酶活,以藤黃微球菌(ATCC4698)為指示菌,在溶菌酶的水解作用下,微球菌在450 nm 處的吸光度(A450)降低。一個(gè)溶菌酶的酶活單位被定義為在25 ℃、pH 6.2 條件下,使用藤黃微球菌懸濁液在450 nm 處引起吸光度每分鐘變化量為0.001 所需的溶菌酶量。稱取10~15 mg 藤黃微球菌溶于50 mL 無(wú)菌磷酸緩沖液(pH 6.2)中,傾斜混勻,放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。用PBS 溶液校對(duì)空白,起始底物溶液的A450控制在0.70±0.1 內(nèi)。首先取蛋清溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,酶活 40 000 U·mg-1),用磷酸緩沖液(pH 6.2)配置濃度梯度為 1 000,500,250,125,50,25,0 U·mL-1的酶標(biāo)準(zhǔn)溶液,取 100 μL 酶標(biāo)準(zhǔn)溶液并與2.9 mL 菌懸液迅速混勻,記錄A450:反應(yīng)1 min 為A1,反應(yīng)3 min 為A2,計(jì)算吸光度每分鐘平均下降值以酶活為縱坐標(biāo),單位時(shí)間內(nèi)吸光度變化量為橫坐標(biāo),作蛋清溶菌酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)發(fā)酵上清液做相同處理,根據(jù)酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。
1.2.5 表達(dá)蛋白的純化及其效果評(píng)價(jià)
為提升純化效果,在37 ℃條件下,對(duì)發(fā)酵液上清做真空旋轉(zhuǎn)濃縮處理。取濃縮樣作為蛋白純化上樣樣品。蛋清溶菌酶的等電點(diǎn)在11.0~11.5,在緩沖液pH 為7.4 時(shí)帶正電荷,選用SP-Sepharose FF。蛋清溶菌酶的分子質(zhì)量約為14.4 kDa,據(jù)此選用Sephadex G-50 進(jìn)行蛋白純化。同時(shí)用2 種方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,并比較2 種方法的效果。
離子交換層析。填料經(jīng)HCl-NaOH 先后預(yù)處理后裝柱,用 20 mmol·mL-1磷酸鹽緩沖液(pH 為7.4)沖洗平衡,取 2 mL 濃縮樣品,PBS 緩沖液稀釋至10 mL,于4 ℃靜置2 h,使目的蛋白充分帶上正電荷。樣品以1 mL·min-1的速度在壓力泵上樣,再轉(zhuǎn)用緩沖液清洗(流速為2 mL·min-1)。電腦核酸蛋白檢測(cè)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)并記錄洗脫液的A280,洗脫至基線后,依次用含 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mol·mL-1NaCl的磷酸緩沖液梯度洗脫,流速不變。根據(jù)洗脫峰分別收集洗脫液,于-20 ℃過(guò)夜,成固體后,放于真空冷凍干燥機(jī)中凍干36 h,收集粉末即得蛋清溶菌酶初步純化產(chǎn)品。
分子篩層析。稱取15 g 填料煮沸,過(guò)夜冷卻后裝柱,4 mL 濃縮樣品上樣,流速 0.2 mL·min-1,選用0.1 mmol·L-1醋酸銨溶液(pH 為 7.2)作為洗脫液,電腦核酸蛋白檢測(cè)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)并記錄A280,洗脫至基線。收集洗脫峰液體,于-20℃過(guò)夜,成固體后,真空干燥。取適量粉末溶解后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,由條帶初步判定純化效果。
蛋清溶菌酶基因的密碼子與經(jīng)優(yōu)化后替換為堿基的基因比對(duì),如圖2 所示,同時(shí)添加了終止子TGA。圖中,* 表示堿基一致,為半保守突變,空格表示保守突變??梢?jiàn)將蛋清溶菌酶基因替換為畢赤酵母所偏好的密碼子后,更符合酵母自身的翻譯體系,表達(dá)量可能會(huì)有所增加。
通過(guò)設(shè)計(jì)與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K 具有同源區(qū)段的引物,以優(yōu)化后的合成基因片段為模板,通過(guò)高保真PCR 擴(kuò)增出帶同源臂的coEWL基因的ORF 區(qū)段,獲得422 bp 目的基因片段,其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3 所示。采用無(wú)縫克隆技術(shù)連接至酶切后pPIC9K 線性空載體,構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9K-coEWL。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后,篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒,經(jīng)BamHI、SalI 雙酶切后,得到 2 614 bp 和 7 037 bp 目的基因片段,結(jié)果如圖4 所示。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pPIC9K-coEWL構(gòu)建正確。
圖2 蛋清溶菌酶序列與優(yōu)化后基因比對(duì)Fig.2 Alignment of egg white lysozyme sequence and optimized gene
圖3 coEWL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 PCR product of coEWL M:DL2 000 標(biāo)志物,1:雙酶切條帶。
電轉(zhuǎn)化后的酵母菌液在MD 平板上初步篩選出His+轉(zhuǎn)化子,如圖5 所示,用無(wú)菌水清洗MD 平板上的菌落后,轉(zhuǎn)涂G418 濃度梯度平板,30 ℃培養(yǎng)2~3d。鑒于酵母菌長(zhǎng)勢(shì)良好,逐步提升G418 濃度,考慮遺傳霉素的高抗性可能與高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生有關(guān),最終在濃度為 15 mg·mL-1的 G418 YDP 平板上隨機(jī)選取多個(gè)轉(zhuǎn)化子,進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證。按上述方法制得模板,pPIC9K 通用引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物,電泳凝膠結(jié)果如圖6 所示,其中2 200 bp 左右條帶為 GS115 野生型的 AOX1 基因,890 bp 左右條帶為目的基因片段(393 bp)與 pPIC9K 上 AOX1 基因(492 bp)之和,結(jié)果表明,攜帶有優(yōu)化蛋清溶菌酶基因的線性化質(zhì)粒已經(jīng)重組到酵母基因組內(nèi),而且此菌株為Mut+型,可以有效利用甲醇進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。將此菌株命名為G-p-coEWL,作為發(fā)酵表達(dá)菌株。
圖5 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子平板鑒定Fig.5 Identification of Pichia pastoris transformant
圖6 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子菌落PCR 驗(yàn)證Fig.6 PCR product of Pichia pastoris transformant
G-p-coEWL首先利用BMGY 培養(yǎng)基培養(yǎng)足夠量菌體,24~36 h 后取適量經(jīng)離心后的菌體,重懸于250 mL BMMY 培 養(yǎng)基中 ,起始 OD600控制在 1.0 左右。誘導(dǎo)96 h,離心收集發(fā)酵上清液。經(jīng)TCA 處理后,用SDS-PAGE 分析,可以觀察到在14.4 kDa 處有逐漸變濃的條帶,此為目的條帶,如圖7 所示。24 h 后蛋清溶菌酶開始表達(dá),且表達(dá)量逐漸上升。
圖7 發(fā)酵上清液蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of fermentation supernatant protein
按照上述試驗(yàn)方法繪制蛋清溶菌酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定取樣樣品酶活。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo),每12 h 樣品酶活為縱坐標(biāo)作圖,其結(jié)果如圖8 所示。由圖8 可知,在250 mL 搖瓶發(fā)酵表達(dá)中,酶活在36 h 處提升較明顯,這可能與酵母自身系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)。72 h 后酶活趨于平穩(wěn),甚至有所降低。發(fā)酵上清液中酶活最高約為677 U·mL-1。
圖8 發(fā)酵上清酶活變化Fig.8 Lysozyme activity of supernatant
首先,繪制BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后,取96 h 發(fā)酵上清液20 μL 與考馬斯染液反應(yīng),測(cè)得A595平均值為0.169,最后,根據(jù)BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到G-p-coEWL的發(fā)酵上清液中總蛋白濃度為0.607 mg·mL-1。
在陽(yáng)離子柱純化過(guò)程中,第一次上樣后將未吸附蛋白洗脫液重復(fù)過(guò)柱,110 min 回歸基線。換濃度梯度NaCl 緩沖液洗脫,每個(gè)濃度都在洗脫20 min 左右后出現(xiàn)洗脫峰,洗脫1 h 后換下一濃度溶液,最后高濃度清洗所有雜蛋白。從洗脫峰體積看,2 mL 樣品中未吸附蛋白占比較大,為80%左右。這與填料體積以及最大吸附量有關(guān)。0.2 mol·L-1NaCl 溶液洗脫液中含有清晰的目的蛋白條帶,同時(shí)含有其他雜蛋白條帶。此pH 值下多種蛋白條帶電荷相同。濃度為0.1 mol·L-1的洗脫峰面積大于濃度為0.2 mol·L-1的,說(shuō)明洗脫峰體積與蛋白含量無(wú)直接關(guān)系。使用Sephadex G-50 純化目的蛋白,共洗脫14.5 h。2 h 左右時(shí)出現(xiàn)第 1 正蛋白峰,5.25 h 時(shí)出現(xiàn)第2 疊加蛋白峰,此時(shí)吸光度還未降至零,11.13 h時(shí)出現(xiàn)面積較大的第3 峰,直到洗脫結(jié)束A280回到基線。
從純化后蛋白的SDS-PAGE 分析圖(見(jiàn)圖9)可知,樣品在過(guò)Sephadex G-50 柱子后,對(duì)目的蛋白的分離效果更佳,最終在14.4 kDa 處得到了單一的目的蛋白條帶。而離子柱下經(jīng)各濃度NaCl 溶液洗脫后的蛋白條帶并不單一,沒(méi)有達(dá)到很好的分離效果。
圖9 純化后蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of purified protein
巴斯德畢赤酵母作為較成熟的真核蛋白表達(dá)體系,已實(shí)現(xiàn)500 多種外源蛋白的表達(dá),各種蛋白表達(dá)量暫不能完全滿足市場(chǎng)需求[9]。研究人員針對(duì)此問(wèn)題提出一系列解決對(duì)策,包括優(yōu)化密碼子、改造信號(hào)肽、添加強(qiáng)啟動(dòng)子等。本實(shí)驗(yàn)參照酵母菌屬的密碼子偏好性,通過(guò)改變外源目的基因的部分堿基序列(精氨酸序列不變),理論上可以提高在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄翻譯頻率,提高外源蛋白的表達(dá)量。YANG等[15]將黑曲霉的2 型脂肪酶基因理性優(yōu)化后,在畢赤酵母中獲得了191 U·mL-1的表達(dá)量,在原16.5 U·mL-1的水平上提升了近10 倍。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)蛋清溶菌酶的密碼子進(jìn)行優(yōu)化,替換了106 個(gè)堿基,氨基酸序列未改變,旨在提高外源基因在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄效率。
在制備酵母感受態(tài)細(xì)胞過(guò)程中,相比于原實(shí)驗(yàn)方法中只使用山梨醇溶液浸泡清洗酵母菌體,本實(shí)驗(yàn)首先采用混合處理液對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行浸泡,再經(jīng)山梨醇溶液清洗獲得酵母感受態(tài)細(xì)胞,其他電轉(zhuǎn)化條件不變。原方法幾乎沒(méi)有篩選出轉(zhuǎn)化子。改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法后,最終得到了一株可抗高濃度G418(15 mg·mL-1)的轉(zhuǎn)化子G-p-coEWL。在現(xiàn)有可見(jiàn)報(bào)道中,電轉(zhuǎn)化獲得酵母重組子可抗G418 的濃度最高為5 mg·mL-1[16]。畢赤酵母高拷貝表達(dá)試劑盒手冊(cè)中提到,可抗?jié)舛葹? mg·mL-1G418 的酵母轉(zhuǎn)化子體內(nèi)拷貝數(shù)達(dá)7~12 個(gè),高抗性的產(chǎn)生可能與外源基因插入的拷貝數(shù)有關(guān)[17]。在G-p-coEWL中需要插入的外源基因拷貝數(shù)有待通過(guò)RT-PCR 等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。
重組酵母菌G-p-coEWL,經(jīng)搖瓶發(fā)酵雖能成功表達(dá)溶菌酶蛋白,但產(chǎn)量和活性沒(méi)有達(dá)到理想的發(fā)酵水平,可能與發(fā)酵方式和發(fā)酵參數(shù)未優(yōu)化有關(guān),以此為基礎(chǔ),后期通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)(特別是通氣條件)或采用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵,預(yù)計(jì)發(fā)酵水平可以提高50~100 倍。張洋[18]將海參i-型溶菌酶及基因優(yōu)化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵表達(dá),在搖瓶條件下只獲得了8.79 U·mL-1的表達(dá)產(chǎn)物,采用5 L 發(fā)酵罐表達(dá)后,酶活提高了近52 倍。另外,G-p-coEWL菌株為Mut+型,能高效利用甲醇進(jìn)行外分泌表達(dá),發(fā)酵周期比Mut-型菌株縮短近一半,目的蛋白外分泌表達(dá)也使后期發(fā)酵產(chǎn)品純化更簡(jiǎn)單,這些優(yōu)勢(shì)極大地降低了溶菌酶的生產(chǎn)成本,對(duì)溶菌酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)具有至關(guān)重要的意義。
同時(shí),本文比較了Sephadex G-50 和SPSepharose FF 這兩種純化方法,可以看出樣品在過(guò)Sephadex G-50 柱后,對(duì)目的蛋白的分離效果更佳,但是Sephadex G-50 柱花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),所以仍需尋找合適的蛋白分離方法。
浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)2020年4期