尹端端 王真真 周文文 王小玉 趙子舒 楊雁鴻

【摘要】目的：探討1，25二羥基維生素D3（1，25（OH）2D3）聯(lián)合順鉑（DDP）在體外對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能存在的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞，MTT法檢測1，25（OH）2D3和DDP對Hela細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。Western blot檢測1，25（OH）2D3和DDP對Hela細(xì)胞內(nèi)P27蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果：所選濃度范圍內(nèi)（10-8～10-6mol/L）的1，25（OH）2D3對Hela細(xì)胞的增殖抑制差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但與作用時(shí)間密切相關(guān)（P<0.05），DDP濃度在5-20μg/ml范圍內(nèi)對Hela細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并呈濃度及時(shí)間依賴性（P<0.01）。流式細(xì)胞儀檢測到1，25（OH）2D3處理12h后聯(lián)合DDP組G0/G1期（DNA合成期）細(xì)胞比例明顯增多（P<0.01）。Western blot觀察到1，25（OH）2D3處理12h后聯(lián)合DDP組細(xì)胞內(nèi)P27蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）。結(jié)論：1，25（OH）2D3可能通過上調(diào)Hela細(xì)胞內(nèi)P27蛋白表達(dá)水平，與順鉑協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而提高順鉑抗腫瘤作用。

【關(guān)鍵詞】1，25二羥基維生素D3;宮頸癌Hela細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

【中圖分類號(hào)】

R851.7【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】2095-6851（2020）08-128-01

維生素D是機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)不可或缺的重要物質(zhì)，是脂溶性維生素的一員，屬固醇類衍生物。維生素D的重要生物學(xué)作用除了調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝、保持骨骼強(qiáng)壯外，還能夠直接和間接的參與到機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。自從20世紀(jì)80年代人們發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3在人白血病細(xì)胞中的抗增殖效應(yīng)以來，就逐漸確定了它對腫瘤治療的潛力。本實(shí)驗(yàn)將1，25（OH）2D3聯(lián)合DDP作用于宮頸癌Hela細(xì)胞，詳見下文報(bào)道。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細(xì)胞株?宮頸癌Hela細(xì)胞株由秦皇島市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.1.2?藥物?順鉑凍干粉劑 （DDP） （山東齊魯制藥廠生產(chǎn)） ，1，25二羥維生素D3 （1，25（OH）2D3） （Sigma公司產(chǎn)品）。

1.1.3?主要試劑?四甲基氮唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司產(chǎn)品）、胰蛋白酶（北京博奧森產(chǎn)品），P27一抗（沈陽萬類生物），二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔）（沈陽萬類生物），DNA小分子量marker（MBI產(chǎn)品），二甲基亞砜（DMSO） （Amresco產(chǎn)品），DMEM高糖培養(yǎng)基（Corning產(chǎn)品），胎牛血清（ 四季青產(chǎn)品），Annexin V/PI試劑盒（聯(lián)科生物公司）。

1.1.4?主要儀器?CO2電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），酶標(biāo)儀（上?？迫A公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman-Coulter公司生產(chǎn)），圖像掃描系統(tǒng)（6661-9μm，明基電通信息技術(shù)有限公司），凝膠自動(dòng)成像儀（Image Master VDS型，Pharmacia公司，瑞典），半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2?方法

1.2.1?細(xì)胞培養(yǎng)?宮頸癌Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，在5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2-3天用0.25%胰蛋白酶消化傳代一次。

1.2.2?噻唑藍(lán)比色法（MTT）計(jì)算細(xì)胞抑制率?取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于96孔板。對照組（等容積培養(yǎng)基）、1，25（OH）2D3設(shè)5個(gè)濃度組：分別為10-8mol/L、5×10-8mol/L、10-7mol/L、5×10-7mol/L、10-6mol/L，DDP設(shè)4個(gè)濃度組，分別為5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml，1，25（OH）2D3（終濃度為10-6mol/L）聯(lián)合DDP（終濃度為10μg/ml）組及1，25（OH）2D3（終濃度為10-6mol/L）預(yù)處理+DDP（終濃度為10μg/ml）組，分別作用于Hela細(xì)胞24、48、72h后，各孔加入5mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，后各孔加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的二甲基亞砜（DMSO）200μl，震蕩混勻15min，490nm波長酶標(biāo)儀檢測吸光值（OD）。計(jì)算24、48、72h各藥物不同處理?xiàng)l件下對Hela細(xì)胞的抑制率。公式： 抑制率=（對照組平均吸光值-實(shí)驗(yàn)組平均吸光值）/對照組平均吸光值×100%。

1.2.3?流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期?取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。E組空白對照組（等容積DMEM高糖培養(yǎng)基） 、A組1，25（OH）2D3組（終濃度為10-6mol/L）、B組DDP組（終濃度為10μg/ml）、C組1，25（OH）2D3聯(lián)合DDP組及D組1，25（OH）2D3預(yù)處理+DDP組。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h。后制備單細(xì)胞懸液、固定、染色后流式細(xì)胞儀測定，計(jì)算機(jī)可自動(dòng)分析出細(xì)胞周期情況。

1.2.4?Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)P27蛋白的表達(dá)水平?將Hela細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h后分組?？瞻讓φ战M（等容積DMEM高糖培養(yǎng)基）、A組1，25（OH）2D3組（終濃度為10-6mol/L）、B組DDP組（終濃度為10μg/ml）、C組1，25（OH）2D3聯(lián)合DDP組及D組1，25（OH）2D3預(yù)處理+DDP組。培養(yǎng)48h后每孔加入250μl細(xì)胞裂解液（RIPA：PMSF=100：1） 后按以下步驟操作： 提取蛋白、蛋白定量、煮蛋白、配膠、灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗（P27抗體）、加二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔）、顯影。且相應(yīng)蛋白表達(dá)值為條帶的灰度值除以β-actin內(nèi)參值校正。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理?實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采取SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所測得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多因素方差分析用于不同組間的比較，LSD法用于組內(nèi)兩兩的比較。P<0.05判定是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?Hela細(xì)胞增殖的抑制作用

1，25（OH）2D3能抑制Hela細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間依賴性。隨著作用時(shí)間的延長，其對Hela細(xì)胞的抑制率逐漸增高。

DDP能抑制Hela細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間及濃度依賴性。隨著劑量增加及作用時(shí)間的延長，其對Hela細(xì)胞的抑制率逐漸增高。

聯(lián)合1，25（OH）2D3可明顯提高DDP對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.2?聯(lián)合應(yīng)用對Hela細(xì)胞的影響

E組體現(xiàn)的為未加藥物處理的宮頸癌Hela細(xì)胞，B、C、D各組細(xì)胞周期中G0/G1期比例均較E組增加（P<0.01）;C、D各組中G0/G1期比例均較B組增加（P<0.01），D組中G0/G1期比例較C組增加（P<0.01）

2.3?聯(lián)合應(yīng)用對Hela細(xì)胞內(nèi)P27蛋白的影響

結(jié)果顯示：A～D各組與E組相比，各組細(xì)胞內(nèi)P27蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01），C、D組P27蛋白表達(dá)較B組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），D組相較于C組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）

3?討論

1，25（OH）2D3就是近年來的研究熱點(diǎn)之一。目前了解到的1，25（OH）2D3抗腫瘤作用機(jī)理包括引起G0/G1期細(xì)胞堆積、上調(diào)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP）的表達(dá)、抑制腫瘤細(xì)胞周圍血管的生成等，進(jìn)而達(dá)到減少癌細(xì)胞增殖分化、轉(zhuǎn)移及浸潤。有研究顯示1，25（OH）2D3可作為潛在輔助治療手段。

本研究提示無論是單藥1，25（OH）2D3、DDP還是兩藥聯(lián)合應(yīng)用，都能使宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖分化被抑制。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3預(yù)處理12h后序貫順鉑組比1，25（OH）2D3聯(lián)合順鉑同時(shí)處理組的細(xì)胞增殖抑制作用更顯著，由此可見，1，25（OH）2D3能提高DDP對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制效果。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞技術(shù)檢測顯示，單藥順鉑能使Hela細(xì)胞周期于G0/G1期堆積;單藥1，25（OH）2D3作用一定時(shí)間后亦可使Hela細(xì)胞周期積滯在G0/G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖分化，其中，1，25（OH）2D3預(yù)處理12h后加順鉑組Hela細(xì)胞周期中G0-G1期細(xì)胞比例增高最顯著，可見，1，25（OH）2D3可以提高DDP對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制效果。本實(shí)驗(yàn)中Western Blot的研究結(jié)果顯示：與空白對照組比對，各組Hela細(xì)胞內(nèi)P27蛋白表達(dá)均有不同程度的增加。其中1，25（OH）2D3預(yù)處理12h后序貫DDP組Hela細(xì)胞內(nèi)P27蛋白表達(dá)增多最明顯。

以上結(jié)果顯示，1，25（OH）2D3有提高DDP對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制效果的作用，其抗腫瘤機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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