肖芳

（南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院 江西南昌330003）

雷公藤甲素（Triptolide,TP）是雷公藤的主要成分之一，具有顯著的免疫抑制和抗炎鎮(zhèn)痛作用，但它的毒性很強(qiáng)，急性中毒主要表現(xiàn)為肝損傷和胃腸道毒性，長期毒性表現(xiàn)為抑制骨髓，損害心臟、腎臟等器官[1～2]。白芍，苦、酸，微寒。歸肝、脾經(jīng)，具有斂陰柔肝、緩急止痛的作用。現(xiàn)代研究表明，白芍具有護(hù)肝和調(diào)節(jié)免疫的作用，《中華本草》中記載白芍具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用。有研究表明，白芍可對抗雷公藤多苷造成的小鼠急性肝損傷，降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及丙二醛（MDA）含量，提高機(jī)體抗氧化能力[3～4]。本研究以正常人肝細(xì)胞L-02 細(xì)胞為模型研究TP 配伍芍藥苷對L-02 細(xì)胞毒性的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料

SW-CJ-2F 雙人雙面超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），L-02 細(xì)胞（購于中科院上海細(xì)胞庫），噻唑蘭（MTT，北京索來寶有限公司），酶標(biāo)儀（Thermo公司），96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（賽默飛世尓生物化學(xué)制品有限公司），雷公藤甲素對照品（成都普菲德生物科技有限公司，批號(hào)：20150813，純度≥98%）；芍藥苷對照品（成都普菲德生物科技有限公司，批號(hào)：16011402，純度純度≥90%）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將L-02 細(xì)胞置于常規(guī)培養(yǎng)皿內(nèi)，以高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37℃、5%二氧化碳（CO2）和相對濕度90%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期L-02 細(xì)胞，棄去原有培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化，將細(xì)胞均勻種于96 孔板上，所用細(xì)胞密度為 5×104個(gè) /ml，每孔 200 μl，每個(gè)濃度設(shè)置 6個(gè)復(fù)孔，分別設(shè)空白，陰性和8 個(gè)濃度，96 孔板最外圈加 200 μl 無鈣鎂的 D-Hanks 緩沖液（HBSS）進(jìn)行液封。細(xì)胞種板完后放于細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)24 h。

2.2 藥物溶液的配制

2.2.1 TP 溶液的配制 先用二甲基亞砜（DMSO）將TP 粉末溶解，再用培養(yǎng)液配制成20 μg/ml 的TP溶液（容量瓶要先加一部分水浴加熱好的培養(yǎng)液，且稀釋的整個(gè)過程中容量瓶均要放于水浴鍋中預(yù)熱，防止藥物析出）。以20 μg/ml 的TP 母液逐級(jí)稀釋成以下濃度：200.000 0 ng/ml，100.000 0 ng/ml，50.000 0 ng/ml，25.000 0 ng/ml，12.500 0 ng/ml，6.250 0 ng/ml，3.125 0 ng/ml，1.562 5 ng/ml。

2.2.2 芍藥苷溶液的配制 精密稱取10 mg 芍藥苷置于10 ml 容量瓶中，加入培養(yǎng)液適量，超聲2 min 使溶解，并定容至刻度，配成1 mg/ml 的母液。母液逐級(jí)稀釋成以下濃度：1 000.0 μg/ml，500.0 μg/ml，250.0 μg/ml，100.0 μg/ml，50.0 μg/ml，25.0 μg/ml，12.5 μg/ml。

2.2.3 TP、 芍藥苷配伍溶液的配制 將TP 與芍藥苷分別以 1:100，1:500，1:1 000，1:2 000 的比例配成以下濃度的溶液：200.000 0 ng/ml，100.000 0 ng/ml，50.000 0 ng/ml，25.000 0 ng/ml，12.500 0 ng/ml，6.250 0 ng/ml，3.125 0 ng/ml，1.562 5 ng/ml。

2.3 MTT 法測定L-02 細(xì)胞毒性 將培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞取出，吸去培養(yǎng)液，用HBSS 液清洗2 遍后，分別加入上述配制不同濃度的藥物溶液，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，空白和陰性組加入空白培養(yǎng)液，加入置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取出，吸去藥物溶液，用HBSS 液清洗 1 遍后，每個(gè)孔加入 20 μl 的 MTT 溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出，吸去MTT 溶液，加入200 μl DMSO 溶液，在微型振蕩器上振蕩10 min。設(shè)置酶標(biāo)儀的吸收波長為490 nm 測定各樣品吸光度。細(xì)胞存活率=（OD 試驗(yàn)組－OD 陰性組）/（OD 陰性組－OD 空白組）×100%，其中OD 值為各組的吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 TP 對L-02 細(xì)胞毒性的影響 TP 在12.500 0～200.000 0 ng/ml 的濃度范圍內(nèi)細(xì)胞存活率均＜90%，且隨濃度的增加，其細(xì)胞存活率越小，說明TP在12.500 0～200.000 0 ng/ml 的濃度范圍內(nèi)對L-02細(xì)胞存在毒性。見表1。

表 1 TP 對 L-02 細(xì)胞毒性的影響（n=6，）

表 1 TP 對 L-02 細(xì)胞毒性的影響（n=6，）

組別 OD 值 細(xì)胞存活率（%）空白陰性200.000 0 ng/ml TP 溶液100.000 0 ng/ml TP 溶液50.000 0 ng/ml TP 溶液25.000 0 ng/ml TP 溶液12.500 0 ng/ml TP 溶液6.250 0 ng/ml TP 溶液3.125 0 ng/ml TP 溶液1.562 5 ng/ml TP 溶液0.069±0.008 0.470±0.019 0.339±0.030 0.379±0.030 0.367±0.044 0.326±0.021 0.334±0.022 0.470±0.037 0.511±0.044 0.467±0.038-100.000 67.371 77.222 74.221 64.004 66.082 99.958 98.181 99.127

3.2 芍藥苷對L-02 細(xì)胞毒性的影響 芍藥苷在12.5～1 000.0 μg/ml 的濃度范圍內(nèi)，L-02 細(xì)胞的存活率均＞90%，表明芍藥苷在此濃度范圍內(nèi)對L-02 肝細(xì)胞不產(chǎn)生毒性。見表2。

表2 芍藥苷對L-02 細(xì)胞毒性的影響（n=6，）

表2 芍藥苷對L-02 細(xì)胞毒性的影響（n=6，）

組別 OD 值 細(xì)胞存活率（%）空白陰性1 000.0 μg/ml 芍藥苷溶液500.0 μg/ml 芍藥苷溶液250.0 μg/ml 芍藥苷溶液100.0 μg/ml 芍藥苷溶液50.0 μg/ml 芍藥苷溶液25.0 μg/ml 芍藥苷溶液12.5 μg/ml 芍藥苷溶液0.066±0.006 1.206±0.122 1.260±0.074 1.270±0.089 1.355±0.165 1.278±0.110 1.359±0.099 1.456±0.152 1.286±0.056-100.000 99.461 100.631 107.654 101.081 107.481 100.385 99.494

3.3 TP 配伍芍藥苷溶液對L-02 細(xì)胞毒性的影響當(dāng)TP 與芍藥苷1:100 和1:500 的比例配伍時(shí)，對細(xì)胞的存活率均無影響，當(dāng)TP 與芍藥苷以1:1 000 的比例配伍后可明顯增加L-02 細(xì)胞的存活率，且均＞90%，說明雷公藤甲素與芍藥苷以1:1 000 的比例配伍能降低雷公甲素對L-02 細(xì)胞的毒性作用。見表3。

表3 TP 配伍芍藥苷溶液對L-02 細(xì)胞毒性的影響（n=6）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用MTT 法研究了TP，芍藥苷，TP 與芍藥苷不同比例配伍溶液對L-02 細(xì)胞毒性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP 對L-02 細(xì)胞的無毒范圍在6.250 0 ng/ml 以下，芍藥苷的L-02 細(xì)胞無毒范圍在1 000.0 μg/ml 以下，當(dāng)TP 與芍藥苷以1:1 000 的比例配伍時(shí)，TP 對L-02 細(xì)胞的無毒范圍在200.000 0 ng/ml以下，當(dāng)TP 與芍藥苷以1:2 000 的比例配伍時(shí)，TP對L-02 細(xì)胞的無毒范圍在12.500 0 ng/ml 以下。說明TP 與芍藥苷以1:1000 的比例配伍時(shí)，可降低TP對L-02 細(xì)胞的毒性作用，明顯減輕TP 對L-02 細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞存活率。該結(jié)果為臨床上減毒增效，合理應(yīng)用雷公藤提供了參考。

以往研究表明，TP 誘導(dǎo)L-02 凋亡是通過降低細(xì)胞中超氧化物歧化酶，破壞細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御體系，使得細(xì)胞中的活性氧（ROS）相應(yīng)地增多，從而增加細(xì)胞損傷作用[5]。芍藥苷降低TP 對L-02 細(xì)胞的毒性作用是否跟其能抑制細(xì)胞氧化有關(guān)及其具體作用機(jī)理都有待后期研究探索。