李曉嬌,何健民,韓德仙,何春燕,侯洪波
(保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院,云南 保山,678000)
粗梗稠李(Padusnapaulensis)又稱胭脂果、山李子和鬼眼睛果,為薔薇科稠李屬植物[1-2]。我國集中分布在云南、陜西、貴州等地,緬甸、尼泊爾等國家也有分布[3]。其果實成熟后呈鮮艷的紫紅色,有特殊的香味,在滇西地區(qū)的龍陵、德宏、鳳慶等地常作為水果、果醬和泡果酒食用。粗梗稠李成熟果肉和果汁呈紫紅色,色素豐富,粗梗稠李富含多酚類物質(zhì)[4],且有一定的抗氧化活性。研究人員研究了粗梗稠李色素的提取和穩(wěn)定性[5-6],但對粗梗稠李中花色苷類色素的研究還鮮有報道。本課題組采用乙醇浸提法提取粗梗稠李中的色素,并以花色苷含量為指標,優(yōu)化花色苷的提取工藝,同時考察提取液花色苷的穩(wěn)定性,以期為滇西地區(qū)特色植物粗梗稠李中花色苷類色素的提取、保存以及開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
粗梗稠李,于2018年10月采自云南省德宏州,經(jīng)保山學(xué)院汪建云教授鑒定為薔薇科稠李屬的植物粗梗稠李(Padusnapaulensis)。
無水乙醇、KCl、冰乙酸、石油醚、氨水、無水Na2CO3、Na2SO3、ZnSO4、無水CaCl2、蔗糖,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;濃鹽酸、丙酮,重慶川東化工集團有限公司;無水乙酸鈉、三氯甲烷、L-(+)-抗壞血酸、苯甲酸鈉、NaCl,西隴科學(xué)股份有限公司;甲苯、醋酸乙酯、MgCl2、AlCl3、CuSO4、FeCl3,中國醫(yī)藥(集團)上?;瘜W(xué)試劑公司。
HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;UV-2600紫外-可見分光光度計,日本島津;N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,東京理化;V-5100可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;FD-1型冷凍干燥機,北京德天佑科技發(fā)展有限公司;TDL-4低速臺式離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;PE30酸度計,梅特勒-托利多集團。
1.3.1 粗梗稠李預(yù)處理
預(yù)處理操作如下:
粗梗稠李鮮果洗凈→晾干水分→去核→冷凍干燥→粉碎→過80目篩→干燥保存。
1.3.2 花色苷的提取
稱取1.00 g粗梗稠李粉末,置于25 mL錐形瓶中,加入一定體積的提取劑(乙醇+HCl),恒溫水浴條件下提取花色苷,提取液離心過濾(2 000 r/min,5 min),離心液于4~5 ℃保存,備用。
1.3.3 提取液紫外-可見光譜特征
在波長為200~700 nm,使用紫外-可見分光光度計對粗梗稠李花色苷提取液進行光譜測定,得其紫外-可見特征光譜圖。
1.3.4 理化性質(zhì)測定
參照肖軍霞等[7]的方法,通過溶解性和顏色反應(yīng)等理化性質(zhì)實驗判斷粗梗稠李花色苷的理化性質(zhì)特征。
1.3.4.1 溶解性
分別取水、冰乙酸、體積分數(shù)80%乙醇、三氯甲烷、醋酸乙酯、石油醚、丙酮、甲苯各10 mL于8支比色管中,再分別加入粗梗稠李花色苷濃縮液0.5 mL,觀察其溶解情況。
1.3.4.2 顏色反應(yīng)
(1)在濾紙上滴加3~4滴粗梗稠李提取液,然后置于濃氨水上方熏一段時間,觀察顏色變化。
(2)在濾紙上滴加3~4滴粗梗稠李提取液,然后滴加飽和Na2CO3溶液4~5滴,將其放置在空氣中,觀察顏色變化情況。
(3)準確量取1 mL粗梗稠李提取液于比色管中稀釋至5 mL,滴加2~3滴質(zhì)量分數(shù)為1% Na2SO3溶液,混勻,記錄溶液顏色變化的情況。隨后加入1 mol/L的HCl溶液2~3滴,混勻,記錄溶液變化情況。
(4)準確量取1 mL粗梗稠李提取液于比色管中稀釋至5 mL,滴加3~4滴質(zhì)量分數(shù)為3% FeCl3溶液,搖晃溶液,觀察溶液顏色變化情況。
(5)取粗梗稠李提取液14份,每份1 mL,用0.5 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl將14份粗梗稠李提取液配制為pH 1.0~14.0的溶液,觀察溶液顏色變化情況。
1.3.5 花色苷含量測定
花色苷含量的測定采用pH 示差法[8],在2支比色管中分別加入0.5 mL花色苷提取液,用pH 1.0的KCl緩沖溶液和pH 4.5的乙酸鈉緩沖溶液將其稀釋至10 mL,室溫下平衡30 min,分別在521 nm和700 nm處測定吸光度[9]。按公式(1)計算吸光度值:
A=(A521-A700)pH 1.0-(A521-A700)pH 4.5
(1)
花色苷提取量按公式(2)計算:
(2)
式中:MW=449.2(MW為樣品中主要花色苷的相對分子質(zhì)量);DF,稀釋倍數(shù);V,提取液體積,mL;ε,樣品中花色苷的摩爾吸收系數(shù),ε=26,900;m,粗梗稠李樣品質(zhì)量,g;l,比色皿的厚度,cm。
1.3.6 單因素試驗
以粗梗稠李花色苷的提取量為指標,分別考察乙醇體積分數(shù)、料液比、pH值、提取時間和溫度5個因素對提取量的影響。設(shè)定乙醇體積分數(shù)為60%,料液比為1∶20(g∶mL),提取液pH為2,提取溫度40 ℃,提取時間60 min,固定其他條件,分別考察乙醇體積分數(shù)(20%、40%、60%、80%、100%),提取液pH值(0.5、1、2、3、4),料液比[1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g∶mL)],提取溫度(30、40、50、60、70 ℃),提取時間(30、60、90、120、150 min),對提取量的影響。
1.3.7 正交試驗
依據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇對花色苷提取量影響較大的提取溫度(A)、提取時間(B)、提取液pH值(C)、料液比(D)4個因素進行L9(34)正交實驗,對粗梗稠李花色苷的提取工藝進行優(yōu)化(表1)。
表1 正交因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment
1.3.8 粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性試驗
1.3.8.1 溫度對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
參考劉敬華等[10]的方法略作修改,取0.1 mL粗梗稠李花色苷濃縮液(最優(yōu)條件下提取的粗梗稠李花色苷提取液,于50 ℃下減壓蒸餾至無溶劑餾出),加蒸餾水稀釋至25 mL,在不同的水浴溫度(20、40、60、80 ℃)中加熱,每隔30 min取樣,用冰水快速冷卻后,用蒸餾水定容至25 mL,測定λ531 nm處的吸光度,按公式(3)計算其保存率:
(3)
式中:At,在t時的吸光度;A0,在0時的吸光度。
1.3.8.2 光照對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
參照張弘等[11]的方法并稍作改動,分別取0.1 mL粗梗稠李花色苷濃縮液,加蒸餾水稀釋至25 mL,置于3個比色管中,并分別于室內(nèi)避光處、室外自然光(室外晴天,每日光照時間至少6 h)、室內(nèi)自然光處保存,每隔5 d測定λ531 nm處的吸光度,計算其保存率。
1.3.8.3 金屬離子對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
參照焦巖等[12]的方法稍作修改,分別取0.1 mL粗梗稠李花色苷濃縮液于比色管中,分別加入不同濃度的金屬離子溶液Mg2+、Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Ca2+溶液至25 mL,保存于室內(nèi)避光處,每隔5 d測定λ531 nm處的吸光度,計算其保存率(對照組均為未添加金屬離子的實驗組)。
1.3.8.4 食品添加劑對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性影響
參照李穎暢等[13]的方法稍加修改,分別取0.1 mL粗梗稠李花色苷濃縮液于比色管中,分別加入不同濃度的食品添加劑(蔗糖、苯甲酸鈉、抗壞血酸)溶液至25 mL,保存于室內(nèi)避光處,每隔5 d測定λ531 nm處的吸光度,計算其保存率(對照組均未添加食品添加劑)。
由圖1可知,提取液在紫外光區(qū)280~285 nm處有較強的吸收峰,這主要是花色苷?;Y(jié)構(gòu)的特征峰[14]。同時在531 nm處也有花色苷的特征吸收峰[15],以往文獻報道,500~550 nm是花色苷的最大吸收區(qū)[16],而在275~350 nm也會出現(xiàn)一個最大吸收區(qū)[17-18]。而本研究提取得到的粗梗稠李色素的最大吸收波長分別在285~288和529~532 nm,符合花色苷的最大吸收波長范圍,由此可判斷提取的粗梗稠李色素屬于花色苷類色素。另外,由于531 nm為粗梗稠李花色苷在可見光范圍內(nèi)的最大吸收波長,故本實驗均取531 nm處的測定結(jié)果。
圖1 粗梗稠李花色苷的紫外可見掃描圖譜Fig.1 Absorption spectrum of anthocyanin from fruit ofPadus napaulensis
2.2.1 粗梗稠李花色苷的溶解性
由表2可見,粗梗稠李花色苷易溶于水、冰乙酸、乙醇等極性溶劑,不溶于氯仿、醋酸乙酯、石油醚、丙酮、甲苯等非極性溶劑。所以該色素屬于水溶性色素,符合花色苷色素的性質(zhì)特征。
表2 粗梗稠李花色苷在不同溶劑中的溶解情況Table 2 The dissolution of anthocyanin from fruit ofP. napaulensis in different solvents
2.2.2 粗梗稠李花色苷的顏色反應(yīng)
表3 粗梗稠李花色苷的顏色反應(yīng)Table 3 The color reaction of anthocyanin from fruitof P. napaulensis
如表4所示,隨pH的變化粗梗稠李色素的顏色也隨之變化。在pH 2以下的強酸溶液中,色素溶液為深紅色;當(dāng)pH為3~8之間時,紅色逐漸變淺;在pH為9時,開始有綠色出現(xiàn);pH 10~14時,綠色逐漸加深,并有藍色出現(xiàn)。這與花色苷在酸堿環(huán)境中的呈色反應(yīng)規(guī)律相似[20-21],故粗梗稠李花色苷可根據(jù)需要調(diào)節(jié)為不同的顏色,特別適用于酸性食品。
表4 粗梗稠李花色苷在不同pH值下的顏色Table 4 Color of anthocyanin from fruit of P. napaulensis at different pH
2.3.1 乙醇體積分數(shù)對粗梗稠李花色苷提取量影響
隨著乙醇體積分數(shù)的增大,粗梗稠李花色苷的提取量也隨之增大,當(dāng)乙醇體積分數(shù)為60%時,花色苷提取量達到最大值,為0.519 mg/g(圖2)。
圖2 乙醇體積分數(shù)對花色苷提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extractionrate of anthocyanin注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)
繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)(80%~100%),花色苷的提取量開始降低,且乙醇體積分數(shù)大于80%時,花色苷提取量急劇下降。這可能是因為溶劑的滲透能力會隨乙醇體積分數(shù)的增加而增大,利于花色苷的溶出。而乙醇體積分數(shù)過高時,提取液極性會減小,從而降低花色苷的溶出率[22]。因此,選擇乙醇體積分數(shù)為40%~80%為最佳,但由于在該范圍內(nèi)乙醇體積分數(shù)對花色苷提取量無顯著差異(P>0.05),因而乙醇體積分數(shù)不作為正交實驗設(shè)計的考察因素,實驗使用60%的乙醇溶液提取花色苷。
2.3.2 溫度對粗梗稠李花色苷提取量的影響
如圖3所示,花色苷的提取量隨著提取溫度的升高而增大,40 ℃時,花色苷提取量達到最大值0.558 mg/g,進一步升高溫度花色苷的提取量降低。這是由于升高溫度有助于花色苷的溶出,但花色苷的熱穩(wěn)定性較差,過高的溫度會破壞花色苷C環(huán)結(jié)構(gòu),使其氧化、降解[23-24]。因此,選擇30、40、50 ℃三個水平進行正交試驗。
圖3 溫度對花色苷提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extractionrate of anthocyanin
2.3.3 提取時間對粗梗稠李花色苷提取量的影響
隨著提取時間的增加,粗梗稠李花色苷提取量呈現(xiàn)先增后降的趨勢,當(dāng)提取時間為60 min時,提取量達到最大值,為0.520 mg/g(圖4)。這可能是隨著提取時間的增加,花色苷逐漸溶出,提取量增加,但繼續(xù)延長提取時間,花色苷在熱溶液中穩(wěn)定性較差,發(fā)生氧化分解,從而提取量降低[25-26]。故提取時間水平選取30、60、90 min。
圖4 提取時間對花色苷提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate ofanthocyanin
2.3.4 pH對粗梗稠李花色苷提取量的影響
從圖5可以看出,提取液pH為1時,粗梗稠李花色苷提取量達到最大值,為0.549 mg/g。當(dāng)pH>1時,花色苷提取量下降,這可能是由于pH的升高導(dǎo)致花色苷穩(wěn)定性降低,因此含量降低。由于pH對花色苷的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性影響較大,不同的pH會使花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)化,花色苷一般在酸性條件下比較穩(wěn)定,利于花色苷的保存。因此,選擇pH為0.5、1、2進行正交試驗。
圖5 pH對花色苷提取率的影響Fig.5 Effect of pH on extraction rate of anthocyanin
2.3.5 料液比對粗梗稠李花色苷提取量的影響
由圖6可知,當(dāng)料液比從1∶20提高到1∶50(g∶mL)時,粗梗稠李花色苷提取量逐漸增加,當(dāng)料液比達到1∶50時提取量達到最大值,為0.661 mg/g,當(dāng)料液比大于1∶50時花色苷提取量開始下降。增加溶劑用量,有利于粗梗稠李中的花色苷向提取液擴散,花色苷的提取量增加,但溶劑用量過度增加時會造成花色苷分子間的作用力減弱,穩(wěn)定性降低、易被分解,從而導(dǎo)致花色苷的提取量降低,因此選擇料液比為1∶50(g∶mL)為宜。
圖6 料液比對花色苷提取率的影響Fig.6 Effect of material/liquid ratio on extractionrate of anthocyanin
由表5的直觀分析來看,粗梗稠李花色苷的最佳提取工藝為A3B2C1D3,而從極差結(jié)果分析可知最佳提取工藝為A3B3C1D3,為此,對A3B2C1D3和A3B3C1D3分別進行5次重復(fù)性驗證試驗。
表5 正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal test results
試驗表明,2種工藝下粗梗稠李花色苷的平均提取量分別為0.641和0.673 mg/g,由此可知粗梗稠李花色苷的最佳提取工藝為A3B3C1D3,即乙醇體積分數(shù)為60 %,提取溫度為50 ℃,提取時間為90 min,提取液pH值為0.5,料液比為1∶50 (g∶mL)。且各因素對花色苷提取量的影響順序為:pH(C)>溫度(A)>料液比(D)>提取時間(B)。表6的方差結(jié)果表明,pH、提取溫度、料液比對粗梗稠李花色苷的提取影響均顯著(P<0.05)。由于FC>FA>FD>FB,4個因素對得率影響的大小順序為:C>B>D>A,與表5中的極差分析結(jié)果一致。
表6 方差分析Table 6 Analysis of variance
2.5.1 溫度對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
在相同的加熱時間內(nèi),隨著溫度的升高,粗梗稠李花色苷的保存率隨之下降,且溫度越高下降得越快,同時色差變化也逐漸增大(圖7)。LALEH等[27]研究血紅小檗等4種漿果花色苷在不同溫度下的降解情況,推測可能是由于高溫下花色苷C3位上糖基發(fā)生水解,從而導(dǎo)致穩(wěn)定性降低。此外,溫度升高時,花色苷的構(gòu)型會向查耳酮式轉(zhuǎn)換[28],從而導(dǎo)致溶液變色,色差增大。粗梗稠李花色苷在20~60 ℃下加熱120 min時,花色苷的保存率均較高,在90%以上,因此粗梗稠李花色苷的提取溫度應(yīng)低于60 ℃。
圖7 溫度對花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on the stability of anthocyanins
2.5.2 光照對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
如圖8所示,隨著光照時間的延長,粗梗稠李花色苷在3種存儲方式下的保存率均呈下降趨勢,保存率順序為:室內(nèi)避光處>室內(nèi)自然光>陽光直射處。5 d后室外自然光、室內(nèi)自然光和室內(nèi)避光處的保存率分別為38.6%、44.17%和48.32%,10 d后室外自然光照射下保存率急劇下降為1.94%,而室內(nèi)自然光和室內(nèi)避光處的保存率下降緩慢為41.22%和46.64%。這主要是因為光照強度加大,花色苷易出現(xiàn)酰基脫落的情況,致使穩(wěn)定性和保存率降低[29],因此在實際加工和存儲過程中應(yīng)注意防止陽光直射。
圖8 光照對花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of light on the stability of anthocyanins
2.5.3 金屬離子對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
如圖9-a所示,隨著儲存時間和Mg2+濃度的增加,花色苷的保存率開始下降,下降的趨勢與對照組無明顯差異(P>0.05),說明Mg2+對花色苷的穩(wěn)定性影響不顯著。
如圖9-b所示,當(dāng)溶液中Al3+濃度為0.1 mol/L時,花色苷的吸光度大于對照組,而Al3+濃度<0.1 mol/L時,花色苷的吸光度小于對照組,說明高濃度的Al3+對粗梗稠李花色苷有增色作用。但隨著放置時間的延長,加入Al3+的花色苷和對照組的保存率下降趨勢基本相同,說明Al3+對花色苷的穩(wěn)定性影響不顯著。
如圖9-c、圖9-d所示,Zn2+和Cu2+對粗梗稠李花色苷有一定的破壞作用,5 d后,添加Zn2+和Cu2+的花色苷溶液的保存率降至40%,而對照組的保存率大于40%。且隨著Zn2+和Cu2+濃度的增加,花色苷的保存率逐漸變小,與對照組存在明顯差異(P<0.05)。
如圖9-e所示,加入Fe3+的粗梗稠李花色苷的保存率呈現(xiàn)不斷下降的趨勢,下降幅度均大于對照組(P<0.05)。但Fe3+的濃度越高對花色苷保存率的影響相對越小,可見,F(xiàn)e3+對花色苷的穩(wěn)定性有較大的影響。
如圖9-f所示,加入Ca2+后,花色苷的保存率的變化與對照組相比不顯著(P<0.05),繼續(xù)延長放置時間保存率下降變緩,由此可見,Ca2+對花色苷的穩(wěn)定性影響不顯著。
a- Mg2+;b-Al3+;c- Zn2+;d- Cu2+;e-Fe3+;f-Ca2+圖9 金屬離子對花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of metal ions on the stability of anthocyanins
2.5.4 食品添加劑對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
2.5.4.1 蔗糖對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
如圖10所示,粗梗稠李花色苷中加入蔗糖溶液時,其顏色加深,且蔗糖濃度越大花色苷溶液顏色越深,吸光度越大,說明蔗糖對花色苷有一定的增色作用。隨著放置時間的延長,加入蔗糖的花色苷溶液的保存率下降趨勢較緩,且保存率均高于對照組,這說明蔗糖能夠抑制花色苷的降解,保持花色苷的穩(wěn)定性。
圖10 蔗糖對花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of sucrose on the stability of anthocyanins
2.5.4.2 苯甲酸鈉對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
如圖11所示,加入不同濃度的苯甲酸鈉后,花色苷的保存率與對照組差異不顯著(P>0.05),但5 d后,對照組保存率下降為46.12%,而加入苯甲酸鈉的花色苷的保存率均大于50%,其中加入0.5、0.8 和1 mmol/L苯甲酸鈉的花色苷的保存率分別為57.22%、57.63%、59.39%,且無明顯差異(P>0.05),因此實際生產(chǎn)中可加入0.5 mmol/L的苯甲酸鈉來增加粗梗稠李花色苷的穩(wěn)定性。
圖11 苯甲酸鈉對花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of sodium benzoate on the stability ofanthocyanins
2.5.4.3 抗壞血酸對粗梗稠李花色苷穩(wěn)定性的影響
如圖12所示,在花色苷溶液中加入抗壞血酸,花色苷的保存率下降,且濃度越大保存率下降的越多。隨著放置時間的增加,加入抗壞血酸的花色苷溶液的保存率均低于對照組,其中加入5和10 mmol/L抗壞血酸的花色苷溶液保存率下降的最快,5 d后降低為9.18%和7.76%,而0.5、1 mmol/L和對照組的保存率分別為38.03%、33.88%和45.96%。這與李穎暢等[13],任二芳等[30]研究結(jié)果一致,抗壞血酸對花色苷有明顯的降解作用,且抗壞血酸濃度越大,花色苷保存率下降的越多。這可能是因為抗壞血酸在接觸氧氣后,發(fā)生氧化反應(yīng)生成H2O2,而H2O2可以直接親核進攻花色苷的C2位,導(dǎo)致花色苷開環(huán),發(fā)生降解[31]。因此,粗梗稠李花色苷溶液中不宜加入高濃度的抗壞血酸。
圖12 VC對花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of VC on the stability of anthocyanins
以滇西地區(qū)特色植物粗梗稠李成熟果實為原料提取花色苷,通過單因素正交試驗優(yōu)化得到最佳提取粗梗稠李花色苷的工藝為:乙醇體積分數(shù)為60%,提取溫度為50 ℃,提取時間為90 min,提取液pH值為0.5,料液比為1∶50 (g∶mL),此條件下花色苷的提取量可達到0.673 mg/g。
粗梗稠李花色苷的保存率隨著溫度的升高和光照增加而降低,因此在粗梗稠李花色苷加工過程中需要避光處理,避光環(huán)境更有利于花色苷溶液的保存;在提取和熱處理時,溫度應(yīng)低于60 ℃,儲藏時應(yīng)存放于4 ℃冰箱內(nèi)。Mg2+和Al3+對粗梗稠李花色苷的穩(wěn)定性影響不大,但Al3+對花色苷有一定的增色作用;Zn2+、Cu2+和Fe3+對花色苷有一定的破壞作用,使保存率下降,但Fe3+的濃度越高對花色苷保存率的影響相對越??;Ca2+對花色苷保存率的影響隨著放置時間的延長而降低。蔗糖和苯甲酸鈉對粗梗稠李花色苷有一定的增色和穩(wěn)定作用;抗壞血酸對花色苷有破壞作用,濃度越大破壞作用越強。
本文從粗梗稠李中提取的色素主要為花色苷類色素,優(yōu)化后的提取工藝操作簡單,穩(wěn)定性較好。同時考察了該花色苷的穩(wěn)定性,為粗梗稠李的深加工和綜合利用提供理論依據(jù)。