超聲作用下虎乳靈芝多糖-硒納米粒子的非酶糖基化抑制作用

肖益東,蔡文斐,鄭趙敏,馬會雨,黃琪琳,2,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070；2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070）

目前糖尿病已成為一個(gè)全球性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題,中國糖尿病流行形勢尤為嚴(yán)峻。中國糖尿病不僅患者數(shù)量巨大,且患病率也高于全球水平,2017年中國糖尿病患病率高達(dá)10.9%[1],并呈現(xiàn)明顯上升趨勢,因此開發(fā)有關(guān)預(yù)防和治療高血糖的產(chǎn)品很有必要。糖尿病的主要特征是高血糖癥,葡萄糖（glucose,Glu）可以通過非酶方法糖化與血漿蛋白生成相應(yīng)的共價(jià)加合物,蛋白質(zhì)糖化和晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products,AGEs）的形成在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵的作用[2]。AGEs是由還原糖羰基與蛋白質(zhì)的自由氨基之間的非酶反應(yīng)或褐變反應(yīng)生成的不可逆的復(fù)雜化合物,也稱為Maillard反應(yīng)產(chǎn)物[3]。目前AGEs抑制劑可用于治療糖尿病及其并發(fā)癥,因此越來越多關(guān)于有效抗糖化劑的研究正在進(jìn)行,以用于治療AGEs導(dǎo)致的相關(guān)疾病。

AGEs的形成可以由Glu自氧化以及脂質(zhì)過氧化引起[4],即與抗氧化之間存在一定關(guān)系,表明抗糖化劑和抗氧化劑也存在一定的關(guān)系。硒（Se）參與許多硒依賴的抗氧化酶的結(jié)構(gòu)和功能,參與細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的保護(hù),是生物學(xué)中至關(guān)重要的元素。硒是谷胱甘肽過氧化物酶等多種酶在細(xì)胞中的活性位點(diǎn),對清除細(xì)胞內(nèi)自由基有直接或間接作用[5-6]。此外,硒和硒蛋白復(fù)合物在抑制自由基和活性氧的傳播方面具有潛在的抗氧化作用。虎乳靈芝菌核提取物主要是一種構(gòu)型為β-(1→3)-D-葡聚糖的大分子多糖[7],虎乳靈芝多糖（Lignosus rhinocerotispolysaccharides,LRP）具有獨(dú)特的多分支結(jié)構(gòu),由于超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)[8-9],其結(jié)構(gòu)會隨之發(fā)生某種程度上的變化,從而影響其生物活性。研究發(fā)現(xiàn)LRP具有抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化等活性,同時(shí)還能促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖[10-12]。

多糖具有抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)的功效,同時(shí)硒能有效清除生物體內(nèi)的自由基,具有較好的保健作用；本實(shí)驗(yàn)以LRP為模板,對其進(jìn)行硒化改性,在超聲處理下合成虎乳靈芝多糖-硒納米粒子（ultrasound treated LRP-selenium nanoparticles,U-LRP-SeNPs）,探究SeNPs對非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用,從而為LRP-SeNPs的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LRP為采用0.5 mol/L NaOH溶液從虎乳靈芝菌核中提取得到的堿溶性多糖[13]；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、氯化硝基四氮唑蘭（nitroblue tetrazolium,NBT）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）、氨基胍（aminoguanidine,AG）、溴酚藍(lán)、Glu 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為2 次去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；FP-6500型熒光光譜儀 日本Jasco公司；DYY-10C型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 LRP-SeNPs的制備

按照Cai Wenfei等[14]研究方法,配制3 份1 mg/mL的LRP溶液70 mL,分別依次加入0、1.167、1.750 mL的Na2SeO3溶液（4 mg/mL）,30 min后依次逐滴加入與Na2SeO3同等體積的抗壞血酸溶液（18 mg/mL）,室溫避光攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)后的混合溶液經(jīng)自來水和蒸餾水分別透析3 d,冷凍干燥后所得樣品按照Se/LRP質(zhì)量比分別標(biāo)記為Na2SeO3/LRP＝1∶15、1∶10。然后取25 mg不同比例的LRP-SeNPs樣品復(fù)溶于10 mL去離子水中,使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)以20 kHz、300 W功率進(jìn)行超聲處理10 min。所得樣品按照Se/LRP質(zhì)量比分別標(biāo)記為U-LRP-SeNPs＝1∶15、U-LRP-SeNPs＝1∶10。

1.3.2 非酶糖基化體系構(gòu)建

參考Zhang Liangshuan等[15]研究方法,無菌條件下向培養(yǎng)瓶中加入4 mL 40 mg/mL BSA溶液和3 mL 2 mol/L Glu溶液,加入含0.02%疊氮鈉的200 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）定容至10 mL,建立完全糖基化體系對照組Fa；如表1所示,同時(shí)設(shè)立不加樣品不含Glu的對照組Fb；加樣品不含BSA的對照組Fc；配制3 mg/mL的U-LRP、U-LRP-SeNPs溶液,設(shè)置終質(zhì)量濃度分別為0.6 mg/mL的抑制組F,以AG為陽性對照。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d,分別于0、3、6、9、12、15 d進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

表1 非酶糖基化體系構(gòu)成Table 1 Composition of glucose-BSA non-enzymatic glycosylation systems

1.3.3 NBT還原能力的測定

取0.25 mL糖基化產(chǎn)物和1.0 mL 0.3 mmol/L NBT（NBT溶于100 mmol/L pH 10.35碳酸鈉緩沖溶液中）,兩者在室溫下混合孵化1 h。在530 nm波長處用紫外-可見分光光度計(jì)測定吸光度[16],用碳酸鈉緩沖溶液代替糖基化物質(zhì)作為空白。

1.3.4 二羰基化合物含量的測定

取0.2 mL糖基化產(chǎn)物,0.1 mL 500 mmol/L吉拉德-T儲備液和1.7 mL 500 mmol/L pH 2.9甲酸鈉溶液在室溫下混合孵化1 h。在294 nm波長處測定吸光度[17],以甲酸鈉溶液代替糖基化物質(zhì)作為空白。

1.3.5 非酶糖基化抑制率的測定

取0.75 mL糖基化產(chǎn)物,測定糖基化終產(chǎn)物在激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm處的熒光強(qiáng)度F[18],按式（1）計(jì)算樣品對非酶糖基化的抑制率。

式中：F為樣品+BSA+Glu的熒光強(qiáng)度；Fa為BSA+Glu的熒光強(qiáng)度；Fb為只含BSA的熒光強(qiáng)度；Fc為只含樣品的熒光強(qiáng)度。

1.3.6 糖基化蛋白生成率的測定

在25 ℃培養(yǎng)15 d后,取出孵化后蛋白；按照Ma Jun等[19]的研究方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）實(shí)驗(yàn)；經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色脫色后,用凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image Lab 3.0軟件分析原BSA和糖基化BSA的光密度值,按式（2）計(jì)算糖基化蛋白的生成率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 組平行,3 次重復(fù),所有數(shù)據(jù)以O(shè)rigin Pro 2015軟件進(jìn)行處理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 非酶糖基化體系條件的確定

Glu通過非酶方法糖化與血漿蛋白反應(yīng)形成共價(jià)加合物,最終生成的AGEs在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。非酶糖基化和氧化反應(yīng)之間具有密切聯(lián)系,氧化反應(yīng)參與非酶糖基化反應(yīng),糖基化反應(yīng)同時(shí)又促進(jìn)氧化反應(yīng)[20]。AGEs主要通過破壞與其交聯(lián)的蛋白質(zhì),促進(jìn)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。在非酶糖基化的第一階段,還原糖與游離氨基反應(yīng)生成席夫堿,進(jìn)一步反應(yīng)生成穩(wěn)定的酮胺,即Amadori產(chǎn)物；Amadori產(chǎn)物在堿性溶液還原NBT,在530 nm波長處產(chǎn)生最大吸收波長,因此可用果糖胺比色法測定蛋白質(zhì)初期糖化的程度。在第二階段,通過氧化脫水,Amadori產(chǎn)物隨后降解成多種α-二羰基化合物,這些化合物反應(yīng)能力更強(qiáng)。在第三階段,α-二羰基化合物再次與游離氨基反應(yīng),通過氧化、脫水和環(huán)合反應(yīng),形成具有熒光的、不可逆的終產(chǎn)物,通常稱為AGEs[21-22]。AGEs會引起不同類型的蛋白質(zhì)修飾,導(dǎo)致機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能的損害。因此,本實(shí)驗(yàn)在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中構(gòu)建非酶糖基化體系,使用AG作為陽性對照,反應(yīng)15 d來評價(jià)U-LRP-SeNPs對AGEs形成的抑制作用。

2.2 NBT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究可知U-LRP-SeNPs具備較好的穩(wěn)定性,U-LRP-SeNPs溶液能夠保持均相體系（均勻分散、不會發(fā)生明顯的相分離和分層現(xiàn)象）16 d,沒有任何明顯的沉淀產(chǎn)生,粒徑略有增加但基本都保持在200 nm內(nèi)[14]。而非酶糖基化體系反應(yīng)時(shí)間較長,為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)研究超聲處理后的U-LRP-SeNPs體系對非酶糖基化的抑制作用,其中BSA+Glu為完全糖基化組,AG+BSA+Glu為陽性對照組,U-LRP-SeNPs+BSA+Glu為抑制組。

在蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)發(fā)生的早期階段,還原糖與存在于蛋白質(zhì)中的自由氨基反應(yīng)生成席夫堿,然后產(chǎn)生穩(wěn)定的酮胺,也稱為Amadori產(chǎn)物[22-23]。Amadori產(chǎn)物可以還原NBT,然后在530 nm波長處產(chǎn)生最大吸收峰的有色反應(yīng)物[24],因此可以通過NBT還原實(shí)驗(yàn)來研究非酶糖基化反應(yīng)初期的情況。

圖1 NBT還原能力隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.1 Determination of NBT reducing power as affected by U-LRP and U-LRP-SeNPs

圖1為不同Se/LRP質(zhì)量比的U-LRP-SeNPs對NBT還原實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物抑制效果?？梢园l(fā)現(xiàn),終質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí),U-LRP和U-LRP-SeNPs對Amadori產(chǎn)物的形成具有一定的抑制活性,但抑制效果較差,存在時(shí)間的依賴性。在反應(yīng)初期（0～4 d）,Amadori產(chǎn)物增加最為迅速,其后增長速率有所下降。在15 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),U-LRP-SeNPs＝1∶15對Amadori產(chǎn)物的抑制作用相對較好,抑制NBT還原能力依次為U-LRP-SeNPs＝1∶15＞U-LRP-SeNPs＝1∶10。整體結(jié)果表明,U-LRP-SeNPs對糖基化反應(yīng)初期的抑制作用不明顯。這主要是因?yàn)長RP自身含有部分還原糖,反應(yīng)初期糖類參與自由氨基反應(yīng),因此抑制效果不明顯。

2.3 二羰基化合物的含量變化

在中間反應(yīng)階段,氧化和脫水后,Amadori產(chǎn)物隨后降解產(chǎn)生具有高反應(yīng)性的二羰基化合物。研究表明,二羰基化合物可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的快速交聯(lián)并產(chǎn)生穩(wěn)定的AGEs[25],大約45%～50%的AGEs來源于二羰基化合物[26]。如圖2所示,二羰基化合物的含量在反應(yīng)初期增長速率較慢,存在一定的時(shí)間依賴性,隨著時(shí)間的延長而逐漸增加。與完全糖基化組相比,加入U(xiǎn)-LRP和U-LRP-SeNPs可以明顯降低二羰基化合物的含量,表明終質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的U-LRP和U-LRP-SeNPs對二羰基化合物的生成有較好的抑制效果。在第15天時(shí),U-LRP-SeNPs＝1∶15和U-LRP-SeNPs＝1∶10表現(xiàn)出較好的抑制能力,抑制率分別為50%和46%,且U-LRP-SeNPs抑制效果明顯強(qiáng)于U-LRP,這與SeNPs的存在有一定關(guān)系。研究表明硒可以阻斷自由基鏈反應(yīng)[27],其次,具有較大比表面積的SeNPs可以提供許多與自由基結(jié)合的相關(guān)位點(diǎn),屏蔽或終止了自由基反應(yīng),從而有效抑制自由基引發(fā)的氧化反應(yīng)。通常,SeNPs的比表面積與SeNPs尺寸密切相關(guān),其中,粒徑越小,比表面積相應(yīng)越大[14]。此外,SeNPs的穩(wěn)定性對清除自由基有積極作用[14],因?yàn)镾eNPs的穩(wěn)定性較差會導(dǎo)致更多的SeNPs聚集,活性表面減少,與自由基結(jié)合的位點(diǎn)減少,從而導(dǎo)致游離的高能態(tài)自由基增多,繼而引發(fā)氧化反應(yīng),而超聲處理有效提高了U-LRP-SeNPs的分散穩(wěn)定性,使SeNPs與自由基結(jié)合的位點(diǎn)增多,從而屏蔽甚至清除自由基。

圖2 二羰基化合物含量隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.2 Determination of dicarbonyl compounds as affected by U-LRP and U-LRP-SeNPs

2.4 終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度分析結(jié)果

在反應(yīng)末期,α-二羰基化合物再次與自由基反應(yīng),通過氧化、脫水和環(huán)化等一系列相關(guān)反應(yīng),形成產(chǎn)生熒光的終產(chǎn)物[22]。如圖3所示,到反應(yīng)末期時(shí),與完全糖基化組相比,加入終質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的U-LRP-SeNPs可以有效降低熒光強(qiáng)度；其中陽性對照AG組熒光強(qiáng)度明顯降低,表明U-LRP-SeNPs和AG能有效抑制AGEs的形成,其中U-LRP-SeNPs＝1∶10和U-LRP-SeNPs＝1∶15整體的抑制效果較好,處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。表2所示為U-LRP和U-LRP-SeNPs對糖基化過程中AGEs的具體抑制率變化。其中U-LRP-SeNPs組對糖基化具有較好的抑制作用,從第8天開始,U-LRP-SeNPs＝1∶15抑制率基本保持在20%左右；U-LRP-SeNPs＝1∶10抑制率隨著時(shí)間的延長略有下降但基本保持在30%,前期抑制效果較好,高達(dá)37%,后期因抑制劑部分消耗因此有所下降。此外U-LRP抑制效果不理想,直到反應(yīng)末期才達(dá)到10%左右。研究發(fā)現(xiàn),某些物質(zhì)抗糖基化活性與抗氧化活性密切相關(guān)[28],氧化反應(yīng)和非酶糖基化反應(yīng)兩者相互作用,參與并促進(jìn)對方體系的反應(yīng)。氧化應(yīng)激能激活蛋白激酶C,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和相關(guān)因子的表達(dá),造成糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。AGEs主要通過破壞與其交聯(lián)的蛋白質(zhì),促進(jìn)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。在之前的抗氧化研究中,U-LRP-SeNPs被證實(shí)是具有較好的抗氧化的能力[14],SeNPs的存在是增強(qiáng)體系抗氧化活性的關(guān)鍵因素。而本實(shí)驗(yàn)中U-LRP-SeNPs對AGEs的抑制作用明顯強(qiáng)于U-LRP,證實(shí)了氧化反應(yīng)和非酶糖基化反應(yīng)兩者之間存在一定關(guān)系,同時(shí)也說明SeNPs是抑制兩者反應(yīng)發(fā)生的重要因素。

圖3 終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.3 Determination of fluorescence intensity of AGEs as affected by U-LRP and U-LRP-SeNPs

表2 終產(chǎn)物抑制率Table 2 Inhibitory ratios of U-LRP-SeNPs on the formation of AGEs

2.5 糖基化蛋白條帶圖譜及生成率的分析結(jié)果

由圖4a可知,在分子質(zhì)量97 kDa處,可見明顯的糖基化蛋白條帶,表明在AGEs形成期間發(fā)生蛋白質(zhì)與多糖之間的交聯(lián)結(jié)合；加入不同抑制劑以后,可以發(fā)現(xiàn)97 kDa處條帶的灰度發(fā)生不同程度的變化,表明抑制劑U-LRP-SeNPs起到了一定的抑制作用。使用圖像分析軟件Image Lab 3.0計(jì)算每個(gè)條帶的強(qiáng)度,糖基化BSA與原始BSA的強(qiáng)度比顯示在圖4b中。U-LRP-SeNPs抑制了糖基化BSA條帶的形成,抑制作用U-LRP-SeNPs＝1∶15大于U-LRP-SeNPs＝1∶10,由條帶分析可知抑制率分別為45.8%和40.2%,SDS-PAGE與終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢一致。SDS-PAGE結(jié)果表明,U-LRP沒有表現(xiàn)出明顯的抑制效果；作為抑制劑,U-LRP抗糖基化主要抑制糖基化反應(yīng)的第二階段,而在糖基化過程的第一、三階段抑制效果不明顯。AGEs的特征是氧化反應(yīng)參與了熒光分子交聯(lián)的形成,Amadori重排產(chǎn)物的形成涉及的是非氧化反應(yīng)。而U-LRP抗氧化活性較差[14],因此,其非酶糖基化抑制作用也較差[22,29]。綜上所述,兩種不同比例的U-LRP-SeNPs能夠抑制AGEs的形成,可以有效預(yù)防由高血糖引起的機(jī)體損害,這為其在治療糖尿病及其并發(fā)癥和相關(guān)功能食品開發(fā)方面提供了良好的應(yīng)用前景和一定的理論依據(jù)。

圖4 SDS-PAGE糖基化蛋白條帶圖譜及分析Fig.4 SDS-PAGE profile of glycosylat protein bands and analysis

2.6 超聲作用下SeNPs對AGEs作用機(jī)制

圖5 超聲作用下SeNPs抑制AGEs產(chǎn)生的機(jī)制Fig.5 Mechanism of the inhibitory effect of ultrasound treated SeNPs on the generation of AGEs

由先前研究可知,由于超聲空化效應(yīng),支化LRP的纏結(jié)鏈被部分解開,其致密的線團(tuán)結(jié)構(gòu)變得松散,使得SeNPs容易擴(kuò)散到LRP內(nèi)部分支并穩(wěn)定于分支鏈中,其中U-LRP-SeNPs＝1∶10、1∶15時(shí)具有最佳的穩(wěn)定性和較小的粒徑[14]。硒可以中斷自由基鏈反應(yīng),小尺寸的SeNPs具有大的比表面積以提供大量的結(jié)合位點(diǎn)來屏蔽或終止自由基,從而抑制自由基引發(fā)的氧化反應(yīng)。超聲空化效應(yīng)可以破壞聚集物,使SeNPs能夠以盡可能小的尺寸分散并穩(wěn)定在LRP基質(zhì)中,這些具有較大比表面積的SeNPs可以提供許多與自由基結(jié)合的相關(guān)位點(diǎn),屏蔽或終止自由基,最終抑制自由基引發(fā)的氧化反應(yīng)。由圖5糖基化反應(yīng)過程可以發(fā)現(xiàn),糖基化反應(yīng)第二、三階段主要涉及自由基的氧化,第一階段屬于非氧化反應(yīng)。因此,在第一階段,即使有SeNPs的存在,其抑制作用也并不明顯；當(dāng)席夫堿環(huán)化、異構(gòu)化重排生成Amadori產(chǎn)物并進(jìn)一步氧化生成二羰基化合物以及最終生成晚期糖基化產(chǎn)物時(shí),SeNPs存在使得反應(yīng)進(jìn)程受到抑制,且U-LRP-SeNPs具有更好的穩(wěn)定性和比表面積,這使得SeNPs更加充分地參與并抑制自由基引發(fā)的非酶糖基化反應(yīng)的中后期氧化反應(yīng),將非酶糖基化反應(yīng)阻止于氧化階段,從而大大提高了非酶糖基化反應(yīng)的抑制效果。而LRP在整個(gè)過程中并沒有良好的抑制效果,表明SeNPs對非酶糖基化抑制作用的重要性,也從側(cè)面反映出糖基化抑制作用與抗氧化活性密切相關(guān)。

3 結(jié) 論

非酶糖基化和氧化反應(yīng)之間具有密切聯(lián)系,氧化反應(yīng)是非酶糖基化反應(yīng)的中后階段,糖基化反應(yīng)同時(shí)又促進(jìn)氧化反應(yīng)。超聲處理后具有較好抗氧化活性的U-LRP-SeNPs能有效抑制非酶糖基化反應(yīng),且存在一定的劑量依賴效應(yīng)；其中U-LRP-SeNPs＝1∶10、1∶15具有較好的非酶糖基化抑制活性,抑制率分別達(dá)到30%和20%。超聲處理有效提高了U-LRP-SeNPs穩(wěn)定性,SeNPs的穩(wěn)定性對清除自由基有積極作用；具有較大比表面積的SeNPs可以提供許多與自由基結(jié)合的位點(diǎn),屏蔽或終止自由基,有效抑制了自由基引發(fā)的氧化反應(yīng),最終提高非酶糖基化抑制效果。