鄭佳豪 李少南 程 攻

(浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江 杭州 310029)

浮游動(dòng)物在水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著重要作用，其群落結(jié)構(gòu)可以動(dòng)態(tài)反映生態(tài)系統(tǒng)對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。當(dāng)受到農(nóng)藥等環(huán)境污染脅迫時(shí)，不同生態(tài)位的浮游動(dòng)物會(huì)有不同的反應(yīng)，通過觀測(cè)浮游動(dòng)物的種群及群落變化，可以對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況進(jìn)行預(yù)測(cè)。毒死蜱作為中國乃至全球范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的有機(jī)磷殺蟲劑之一，其對(duì)水生生物的影響已在室內(nèi)和室外環(huán)境中均有廣泛的研究，并得到了相應(yīng)的效應(yīng)臨界值，如最高無作用濃度(NOEC)和最低有效濃度(LOEC)[1-2],[3]20,[4],[5]25,[6]。在農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作中，效應(yīng)的臨界值是非常重要的信息，過去的研究中通常只獲得了NOEC或LOEC的理論濃度，本研究將嘗試使用時(shí)間加權(quán)平均濃度。

隆線溞(Daphniacarinata)是水體中常見的甲殼綱動(dòng)物[7-9]，有著易飼養(yǎng)、繁殖快的優(yōu)點(diǎn)，是生態(tài)毒理學(xué)研究的理想受試生物[10]，但隆線溞很難單獨(dú)生長。中華薄殼介(Dolerocyprissinensis)作為一類新興的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，正逐漸受到人們的關(guān)注[11]，本研究將其與隆線溞組成混合種群，來研究毒死蜱對(duì)于隆線溞和中華薄殼介混合種群的影響。

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)是幾丁質(zhì)水解酶的一種，其在水中的主要來源是甲殼綱動(dòng)物在蛻皮時(shí)分泌的蛻皮液[12]。NAGase比活力在個(gè)體層面與動(dòng)物的體長、體重等相關(guān)，在群體層面與種群生物量相關(guān)，故可通過測(cè)定NAGase比活力來判斷農(nóng)藥對(duì)甲殼綱浮游動(dòng)物的影響[13]。

由于幾丁質(zhì)水解酶來源的多重性[14-17]，而且水中的其他化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)促進(jìn)或抑制NAGase的酶促反應(yīng)，因此NAGase比活力的測(cè)定結(jié)果往往不能夠準(zhǔn)確反映被暴露種群的生物量。本研究選擇了用特異性抗體測(cè)定抗原含量的方法來彌補(bǔ)這一缺陷?？紤]到幾丁質(zhì)酶(chitinase)也存在于蛻皮液并與NAGase一起隨著蛻皮過程的結(jié)束而釋放到水中[18]，本研究以隆線溞該酶基因原核表達(dá)蛋白制備抗體，用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)其游離態(tài)幾丁質(zhì)酶免疫可反應(yīng)蛋白(chitinase-IR)來表征它的chitinase。因此，本研究擬通過種群密度、NAGase比活力和隆線溞chitinase-IR的測(cè)量來反映隆線溞和中華薄殼介混合種群在毒死蜱脅迫下的變化。

1 材料與方法

1.1 受試生物

隆線溞和中華薄殼介均采集自浙江大學(xué)華家池，在曝氣后自來水(pH=7.4±0.1、電導(dǎo)率(178±2) μS、總?cè)芙庑喳}(126±2) mg/L、溶解氧(8.0±0.3) mg/L)中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制為(25±1) ℃，預(yù)培養(yǎng)30 d后作為含隆線溞和中華薄殼介的培養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取18個(gè)圓柱形玻璃水缸，給藥前15天，每缸接種含隆線溞和中華薄殼介的培養(yǎng)液各1 L，再加入曝氣后自來水至10 L，最終接種密度為：隆線溞506只/L，中華薄殼介378只/L，每3天添加30 mL螺旋藻粉溶液(2.78 g/L)，使兩種動(dòng)物自然生長。給藥后每天進(jìn)行16 h光照(光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx)，8 h黑暗處理，只要?jiǎng)游锷锪窟€處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，就不再添加螺旋藻粉溶液。

給藥方法：先將毒死蜱原藥用丙酮配制成1 000、100、10 mg/L 3種母液。加入1 000 mg/L的母液52.5 μL得到毒死蜱質(zhì)量濃度為5.25 μg/L的試驗(yàn)組；分別加入100 mg/L的母液164.0、51.0 μL得到毒死蜱質(zhì)量濃度為1.64、0.51 μg/L的試驗(yàn)組；分別加入10 mg/L的母液160.0、50.0 μL得到毒死蜱質(zhì)量濃度為0.16、0.05 μg/L的試驗(yàn)組；僅添加丙酮得到毒死蜱質(zhì)量濃度為0 μg/L的試驗(yàn)組作為對(duì)照。所有試驗(yàn)組都添加丙酮量至164 μL。每組設(shè)立3個(gè)重復(fù)。

1.3 取 樣

參考郎倩萍[19]的取樣設(shè)計(jì)進(jìn)行取樣(見表1)，取樣后用等量曝氣后自來水補(bǔ)充，浮游動(dòng)物計(jì)數(shù)完畢后重新送回。

1.4 樣品測(cè)定

1.4.1 殘留毒死蜱

水樣過0.22 μm濾膜后參考周艷明等[20]的方法進(jìn)行固相萃取，固相萃取方法回收率為93.6%～107.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.79%～4.89%。

固相萃取后用Agilent 7890b氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)器為電子捕獲檢測(cè)器，色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱(0.32 mm×30 m×0.25 μm)。升溫程序?yàn)?50 ℃保持2 min，以15 ℃/min升溫至190 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至240 ℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1 μL，進(jìn)樣口溫度為240 ℃；檢測(cè)器溫度為250 ℃，載氣用高純氮?dú)?純度99.999%)，恒壓為103.425 kPa。毒死蜱的保留時(shí)間為8.700 min，檢出限為0.005 μg/L。

1.4.2 浮游動(dòng)物種群密度

由于中華薄殼介大多貼缸壁生活，所以計(jì)數(shù)前先要進(jìn)行攪動(dòng)，然后取100 mL水樣對(duì)隆線溞與中華薄殼介進(jìn)行肉眼計(jì)數(shù)，重復(fù)10次后取平均數(shù)，計(jì)算種群密度。

1.4.3 幾丁質(zhì)水解酶

將待測(cè)水樣通過0.22 μm的微孔濾膜抽濾處理后，測(cè)定幾丁質(zhì)水解酶，其中NAGase比活力參考HANSON等[21]的方法測(cè)定，檢出限為0.003 3 U/L。

利用郎倩萍等[22]研究得到的隆線溞chitinase原核表達(dá)蛋白制備多克隆抗體。參考KITTELBERGER等[23]的方法進(jìn)行間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA，篩選出抗體的最適反應(yīng)濃度[24]。在抗體最適反應(yīng)濃度下，再用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)量隆線溞chitinase-IR，檢出限為0.024 1 μg/mL。

參考文獻(xiàn)[25]，選取5種甲殼綱動(dòng)物(鋸緣真劍水蚤(Eucylopsserrulatus)、中華薄殼介、掌肢新米蝦(Neocaridinapalmata)、隆線溞和老年低額溞(Simocephalusvetulus))進(jìn)行抗體交叉反應(yīng)性測(cè)定，結(jié)果表明，隆線溞與隆線溞、老年低額溞的交叉反應(yīng)率分別為100.00%、10.46%，而與鋸緣真劍水蚤、中華薄殼介、掌肢新米蝦的交叉反應(yīng)率均小于0.28%。由此可見，測(cè)定的chitinase-IR確實(shí)為隆線溞產(chǎn)生的。

表1 取樣設(shè)計(jì)

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用DPS?軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析[26]。使用CANOCO 5軟件進(jìn)行冗余分析(RDA)[27]。

2 結(jié)果與分析

由表2可見，殘留毒死蜱隨時(shí)間的延長逐漸降低，這是因?yàn)槎舅莉鐣?huì)發(fā)生光解[28-30]，也存在揮發(fā)和缸壁的物理吸附等情況。殘留毒死蜱隨時(shí)間的變化按式(1)進(jìn)行擬合[31],[32]4，得到表3。各試驗(yàn)組的降解速率均隨時(shí)間延長逐漸降低，這是由于毒死蜱的降解產(chǎn)物三氯苯酚對(duì)酶促反應(yīng)和微生物有抑制作用[32]5,[33]。總體而言，毒死蜱質(zhì)量濃度越高的試驗(yàn)組，其平均降解速率越快。

y=ae-bx

(1)

式中：y為殘留毒死蜱質(zhì)量濃度，μg/L；x為時(shí)間，d；a、b分別為擬合系數(shù)。

表2 殘留毒死蜱質(zhì)量濃度1)

表3 毒死蜱的衰減方程

從圖1可以看出，在低質(zhì)量濃度(0.05 μg/L)毒死蜱作用下，毒死蜱可能對(duì)隆線溞及中華薄殼介有一定的刺激作用；但在質(zhì)量濃度高于0.05 μg/L的毒死蜱作用下，兩種生物的種群密度基本均隨毒死蜱暴露濃度的升高而降低。不過，在試驗(yàn)后期，隨著水中殘留的毒死蜱濃度降低，兩種生物的種群密度基本不再減少，隆線溞的種群密度甚至還出現(xiàn)了回升。

圖1 毒死蜱脅迫下的浮游動(dòng)物種群密度變化Fig.1 Zooplankton population density variation under chlorpyrifos exposure

從圖2(a)可以看出，在施藥之后，隨著時(shí)間的延長，毒死蜱逐漸對(duì)NAGase比活力產(chǎn)生了抑制作用，特別是0.51、1.64、5.25 μg/L的試驗(yàn)組，但隨著水中殘留的毒死蜱濃度降低，與浮游植物種群密度變化類似，試驗(yàn)后期NAGase比活力又有所回升。從圖2(b)可以看出，隆線溞chitinase-IR變化與NAGase比活力變化基本一致，但由于抗體的特異性，隆線溞chitinase-IR變化與隆線溞種群密度的變化更加一致。

3 討 論

基于表4的多重比較結(jié)果，得到毒死蜱針對(duì)各測(cè)定參數(shù)的NOEC和LOEC理論值(分別記為NOECnominal和LOECnominal)，再根據(jù)參考文獻(xiàn)[34]中推薦的算法算出與NOECnominal或LOECnominal相對(duì)應(yīng)的時(shí)間加權(quán)平均濃度，分別記為NOECTWA和LOECTWA，結(jié)果如表5所示。

由表5可見，毒死蜱對(duì)隆線溞種群密度的LOECTWA為0.172 μg/L，明顯高于對(duì)中華薄殼介種群密度的LOECTWA(0.051 μg/L)，說明中華薄殼介對(duì)毒死蜱的敏感性要高于隆線溞，這也解釋了隆線溞的種群恢復(fù)速率比中華薄殼介快。NOECTWA的結(jié)果也同樣說明這一問題。

RDA表明，隆線溞和中華薄殼介的因變量分值分別為-0.908 1、-1.084 1，表明毒死蜱對(duì)中華薄殼介的總體影響比對(duì)隆線溞強(qiáng)烈，這與表5中NOECTWA或LOECTWA的表征結(jié)論一致。

本研究中涉及兩種幾丁質(zhì)水解酶，分別是chitinase和NAGase。在NAGase比活力測(cè)定中，膠體幾丁質(zhì)、對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷、4-甲基傘形酮-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUF-NAG)均可以作為底物。以膠體幾丁質(zhì)作為底物[35]時(shí)，由于膠體幾丁質(zhì)的水解一般會(huì)受到chitinase的制約，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不能完全作為NAGase活性的判斷依據(jù)[36]，因此本研究以4-MUF-NAG作為底物，使NAGase比活力測(cè)定結(jié)果更加可靠。

圖2 毒死蜱脅迫下NAGase比活力和隆線溞chitinase-IR變化Fig.2 NAGase specific activity and chitinase-IR of Daphnia carinata under chlorpyrifos exposure

表4 各測(cè)定參數(shù)多重比較結(jié)果1)

表5 各測(cè)定參數(shù)的時(shí)間加權(quán)平均濃度計(jì)算結(jié)果

對(duì)NAGase比活力和隆線溞chitinase-IR進(jìn)行RDA發(fā)現(xiàn)，酶指標(biāo)對(duì)毒死蜱的反應(yīng)不如種群密度敏感，但隆線溞chitinase-IR的敏感性高于NAGase比活力。

4 結(jié) 論

在毒死蜱質(zhì)量濃度高于0.05 μg/L的條件下，毒死蜱對(duì)兩種生物會(huì)有抑制作用，并且基本隨暴露濃度的升高而增強(qiáng)。不過，隨著水中殘留的毒死蜱濃度降低，抑制作用會(huì)減弱。計(jì)算毒死蜱對(duì)隆線溞和中華薄殼介的NOEC和LOEC發(fā)現(xiàn)，中華薄殼介對(duì)毒死蜱的敏感性高于隆線溞。在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作中， NOEC或LOEC使用時(shí)間加權(quán)平均濃度會(huì)使評(píng)價(jià)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

(致謝：隆線溞經(jīng)過南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王新華教授鑒定，中華薄殼介經(jīng)過華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院禹娜教授鑒定，在此一并表示感謝！)