瞿 丞，賀稚非,2，王兆明，劉 超，李俊宏，李洪軍,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究 中心，重慶 400715）

腌制能夠提高原料肉的感官品質(zhì)，是肉制品最為常見的加工技術(shù)之一，通過腌制可以增強肉制品的風味、改善肉制品質(zhì)構(gòu)特性[1]，從而提高肉制品的加工特性。食鹽是一種最為常見的腌制劑，相比于其他腌制劑在加工技術(shù)、保藏和感官屬性等方面具有明顯的優(yōu)勢[2]，被廣泛應(yīng)用于肉制品的加工，對肉制品保藏和風味的形成起至關(guān)重要的作用。食鹽的作用可以包括以下幾個方面[3]：1）通過促進肌原纖維蛋白的溶解提高肉制品的持水力，改善肉的質(zhì)地；2）降低肉制品的水分活度，抑制微生物的生長，避免因微生物生長而引起的腐敗和安全問題；3）調(diào)節(jié)肉制品成熟過程中的生物化學反應(yīng)和酶反應(yīng)，影響最終的產(chǎn)品風味；4）通過提供咸味和改善揮發(fā)性香氣化合物從食物基質(zhì)中的釋放影響肉制品最終的感官特性。

氧化是肉類最重要的非微生物降解途徑之一，會導(dǎo)致肉制品顏色、香氣和風味等感官特性的退化和營養(yǎng)價值的降低[4]。肉類富含豐富的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，但由于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)的特點，容易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的攻擊，導(dǎo)致自身結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化。脂質(zhì)氧化一直以來被認為是影響肉制品品質(zhì)的主要反應(yīng)，由于肉類富含不飽和脂肪酸，容易受到ROS的攻擊而引發(fā)自由基鏈式反應(yīng)，生成初級產(chǎn)物氫過氧化物和次級產(chǎn)物羰基化合物、酮類、醇類和醛類等。而關(guān)于蛋白質(zhì)氧化的研究相對較晚，有研究表明蛋白質(zhì)也是活性氧的攻擊目標，蛋白質(zhì)氧化也會發(fā)生類似于脂質(zhì)氧化反應(yīng)的自由基鏈式反應(yīng)，活性氧對肌肉蛋白的攻擊導(dǎo)致氨基酸殘基被破壞和羰基化合物的生成[5-7]。脂質(zhì)氧化會促進芳香化合物的產(chǎn)生，影響肉的味道和風味；蛋白質(zhì)氧化不僅會導(dǎo)致顏色和質(zhì)地的惡化，還會導(dǎo)致必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的流失，降低蛋白質(zhì)的消化率。有研究[8]表明動物肌肉中的脂質(zhì)氧化會促進蛋白質(zhì)氧化：脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的過氧化氫自由基易被蛋白質(zhì)中的氫原子吸收，形成蛋白質(zhì)自由基，并轉(zhuǎn)化為有助于烷氧自由基和羥基衍生物生成的烷氧基過氧化物；此外，脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的次級產(chǎn)物（醛類化合物）易與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[9-10]，影響其感官和營養(yǎng)特性。

目前，關(guān)于蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化對肉制品品質(zhì)影響的研究相對較多，Li Binbin等[11]用4 種不同氧化程度的豬肉背部脂肪混合豬瘦肉制作川味香腸，結(jié)果表明在發(fā)酵過程中較高的脂質(zhì)氧化組其蛋白質(zhì)氧化程度更高；Wang Zhaoming等[12]用脂質(zhì)氧化副產(chǎn)物丙二醛處理兔肉的肌肉勻漿，結(jié)果表明丙二醛可以與肌原纖維蛋白形成加合物并影響ROS生成系統(tǒng)，導(dǎo)致肌原纖維蛋白氧化加劇?，F(xiàn)階段有關(guān)食鹽、蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)氧化及肉制品品質(zhì)之間的相互作用關(guān)系的文獻研究相對較少，Wen Rongxin等[13]研究發(fā)現(xiàn)30%的NaCl替代（70% NaCl、20% KCl、4%賴氨酸、1%丙氨酸、0.5%檸檬酸、1%乳酸鈣和3.5%麥芽糖糊精）可以降低哈爾濱風干腸的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化水平，且有助于風味的形成。許多研究表明[14-19]，食鹽主要的成分NaCl對脂質(zhì)氧化具有一定的促進作用，本實驗以雞肉為原材料，探究不同食鹽添加量腌制對雞肉脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)氧化和食用品質(zhì)的影響，并對三者之間的聯(lián)系和影響機制進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉購自湖南湘佳牧業(yè)股份有限公司，雞肉品種為三黃雞，平均質(zhì)量為（203.78±5.78）g，平均厚度（從其最厚處測）為（21.25±1.41）mm；食鹽 重慶市購；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA323S電子分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；S25渦旋混合器 德國IKA集團；5810型臺式高速離心機德國Eppendorf公司；UV-16001紫外-可見分光光度計日本島津儀器有限公司；Avanti J-30I冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；DW-86W100超低溫冰箱 青島海爾集團；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Elix10純水機 美國密理博公司；TA.XT.Plus物性測定儀 英國Stable Micro System公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；UltraScan PRO測色儀 美國HunterLab公司。

1.3 方法

1.3.1 雞肉腌制處理

將冷凍的雞胸肉在4 ℃解凍24 h，洗凈后剔除多余的脂肪、結(jié)締組織和肌膜，使其表面平整，體積為10 cm×5 cm×2 cm，質(zhì)量約為150 g。將雞胸肉分為6 組，按照質(zhì)量比1∶1.5加入食鹽質(zhì)量分數(shù)為0%、3%、6%、9%、12%、15%的腌制液中，置于4 ℃腌制36 h。腌制完成后進行取樣，并測定指標。

1.3.2 食用品質(zhì)分析

1.3.2.1 水分含量的測定

參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[20]。

1.3.2.2 pH值的測定

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》[21]。

1.3.2.3 蒸煮損失率的測定

參照農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準NY/T 2793—2015《肉的食用品質(zhì)客觀評價方法》[22]并略作修改。將雞肉沿平行于肌纖維方向切成2 cm×2 cm×3 cm的肉塊，稱質(zhì)量并編號，再加入72 ℃的恒溫水浴鍋中至肉塊中心溫度70 ℃，取出冷卻至室溫后再稱質(zhì)量計算蒸煮損失率，如式（1）所示：

1.3.2.4 色差的測定

參照NY/T 2793—2015[22]并略作修改。將腌制完成后的雞肉的肌肉橫斷面垂直置于經(jīng)過校正的測色儀鏡頭，使肉面緊扣鏡口不漏光，同一食鹽質(zhì)量分數(shù)梯度取5 個樣品，選擇不同的部位測定5 次，記錄亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。

1.3.2.5 質(zhì)構(gòu)的測定

參照Du Lei等[23]并略作修改。將雞肉切割成體積為3 cm×3 cm×2 cm的立方體，濾干表面水分后置于載物臺上，測定其硬度、膠黏性、彈性，每個樣品重復(fù)6 次，取平均值。質(zhì)構(gòu)測定參數(shù)：采用TA.XT.Plus物質(zhì)測試儀，P/36R型探頭，壓縮模式（texture pro file analysis，TPA），測試前速率2.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測試后速率2.0 mm/s，出發(fā)點力5 g，壓縮程度40%，兩次壓縮間隔時間為5.00 s。平行測定7 次，去掉最小值和最大值，最終結(jié)果取剩余5 個值的平均值。

1.3.2.6 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的測定

參考Lan Yang等[24]的方法。取10 g絞碎雞肉樣品，加入20 mL三氯乙酸溶液（0.2 g/mL），在3 000 r/min均質(zhì)處理60 s。隨后4 ℃、3 500×g離心15 min，過濾離心上清液后取5 mL于比色管中，加入相同體積的硫代巴比妥酸溶液（20 mmol/L）。將上述混合液在沸水浴中加熱處理20 min，冷卻至室溫后在532 nm波長處測定吸光度。

1.3.2.7 蛋白質(zhì)溶解度的測定

肌漿蛋白溶解度測定參照扶慶權(quán)等[25]的方法并略作修改。1 g碎肉加入10 mL的0.02 mol/L（pH 7.2）預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，勻漿機以最低速勻漿1 min，放入搖床固定于4 ℃勻速振蕩過夜，取出勻漿液5 000×g離心10 min，上清液肌漿蛋白溶解度采 用雙縮脲方法進行測定。

總蛋白溶解度測定：1 g碎肉加入20 mL 0.1 mol/L（含1.1 mol/L碘化鉀，pH 7.2）預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，按肌漿蛋白同樣的方法和程序進行勻漿、振蕩、離心和測定。

肌原纖維蛋白的溶解度為總蛋白溶解度和肌漿蛋白溶解度的差值。

1.3.3 蛋白質(zhì)氧化分析

蛋白質(zhì)的提取參照Wang Zhaoming等[26]的方法并略作修改。將解凍的雞肉樣品切成小塊并用絞肉機攪碎，取25 g攪碎的雞肉樣品與100 mL含有100 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA-2Na的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）混合，隨后進行均質(zhì)處理。均質(zhì)完成后，4 ℃、2 500×g離心15 min，離心后的上清液即為肌漿蛋白。移除上清液后，再次加入100 mL上述提取液，并重復(fù)均質(zhì)和離心步驟。上述操作重復(fù)3 次后，加入100 mL含有100 mmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液（pH 6.25）并均質(zhì)處理。隨后4 ℃、2 500×g離心15 min，移除上清液后，加入100 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）并均質(zhì)。將均質(zhì)液用雙層紗布過濾以除去結(jié)締組織，4 ℃、2 500×g離心15 min，所得的沉淀即為肌原纖維蛋白樣品。提取的肌原纖維蛋白置于4 ℃并在12 h內(nèi)使用。

1.3.3.1 羰基的測定

參照Wang Zhaoming等[26]的方法并略作修改。將肌原纖維蛋白樣品分別用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）稀釋到質(zhì)量濃度為5 mg/mL，從每一組樣品中分別取2 份蛋白質(zhì)溶液（0.4 mL）于2 mL的離心管中。其中一份用800 μL的2 mol/L HCl溶液（含有0.002 g/mL的2,4-二硝基苯肼）處理，記為處理組；另一份用800 μL的2 mol/L HCl溶液處理，記為空白組。將處理組和空白組樣品在室溫下反應(yīng)30 min后，加入400 μL的三氯乙酸（0.4 g/mL）沉淀蛋白質(zhì)。隨后4 ℃、5 000×g離心5 min，并移除上清液。加入1 mL乙醇-乙酸乙酯混合液（1∶1，V/V）洗滌沉淀以除去未反應(yīng)的2,4-二硝基苯肼，隨后4 ℃、5 000×g離心5 min。上述洗滌過程重復(fù)3 次后，加入1.5 mL的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.5，含有6 mol/L鹽酸胍）溶解沉淀。放置過夜后，在370 nm波長處測定吸光度，蛋白質(zhì)羰基含量根據(jù)摩爾消光系數(shù)（22 000 L/（mol·cm））計算求得。肌漿蛋白羰基的測定同上。

1.3.3.2 巰基的測定

參照Wang Zhaoming等[26]的方法并略作修改。用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）將肌原纖維蛋白稀釋到5 mg/mL，吸取1 mL肌原纖維蛋白懸浮液，用9 mL的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0，包含8 mol/L尿素，0.6 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA-2Na）稀釋。取3 mL的稀釋液于試管中，加入0.4 mL 0.1%的5,5’-二硝基(2-硝基苯甲酸)，隨后在40 ℃避光放置25 min。冷卻至室溫后在412 nm波長處測定吸光度。巰基含量根據(jù)摩爾消光系數(shù)（13 600 L/（mol·cm））計算求得。肌漿蛋白巰基的測定同上。

1.3.3.3 表面疏水性的測定

參照Wang Zhaoming等[26]的方法并略作修改。肌原纖維蛋白用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）稀釋至5 mg/mL，取1 mL的稀釋液與0.2 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溴酚藍（bromophenol blue，BPB）溶液混合。同時制備對照組樣品，即取1 mL磷酸鹽緩沖液加入0.2 mL的溴酚藍溶液。所有樣品在25 ℃振蕩10 min后4 ℃、2 000×g離心15 min。取0.4 mL上清液，加入3.6 mL磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）稀釋，在595 nm波長處測定吸光度。兩分子的BPB會和一分子的蛋白質(zhì)會產(chǎn)生強相互作用，而這種捆綁作用與BPB的表面疏水性有關(guān)，因此用BPB結(jié)合量表示肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的表面疏水性。肌漿蛋白表面疏水性的測定同上。肌原纖維蛋白質(zhì)表面疏水性計算如式（2）所示：

1.3.3.4 SDS-PAGE分析

參照Wang Zhaoming等[26]的方法并略作修改。肌原纖維蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）稀釋為1.5 mg/mL，取1 mL的蛋白質(zhì)稀釋液加入4 mL的buffer緩沖液，在沸水條件下加熱3 min。冷卻至室溫后3 000×g離心5 min，取10 μL上清液上樣。在30 mA的條件下進行電泳。肌漿蛋白溶液同上。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，Origin 9.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用品質(zhì)的變化

2.1.1 pH值

表1 食鹽添加量對雞肉理化特性的影響Table 1 Effect of different NaCl levels on physical and chemical properties of chicken meat

微生物和酶的活動所產(chǎn)生的代謝分子會對肉的pH值產(chǎn)生影響，因此可以根據(jù)pH值對肉的新鮮程度進行初步判斷。由表1可知，食鹽添加量對雞肉的pH值影響顯著（P＜0.05），在低食鹽添加量的腌制條件下，雞肉的pH值有一定程度的增大，在高食鹽添加量的腌制條件下，雞肉的pH值有一定程度的減小。這可能與微生物的生長以及食鹽溶液呈弱酸性有關(guān)，隨著食鹽添加量的增加，其對微生物活動及蛋白酶活性的抑制作用逐漸增強，所以雞肉的pH值逐漸降低，而對于食鹽添加量為0%的樣品，腌制液的pH值呈中性，并非微生物生長的最適pH值，微生物的生長速率在短時間內(nèi)會小于食鹽添加量為3%的樣品，所以空白組的pH值也相對較低。

2.1.2 水分含量

從表1可以看出，食鹽添加量對雞肉的水分含量有顯著影響（P＜0.05），雞肉水分含量隨著食鹽添加量的增加先升高后降低，在食鹽添加量為3%和6%的腌制條件下，雞肉的水分含量顯著高于另外4 種（0%、9%、12%和15%）腌制條件，這表明低食鹽添加量可以促進水與雞肉更緊密的結(jié)合。低食鹽添加量會促進肌原纖維蛋白溶解度、水結(jié)合能力和蛋白質(zhì)基質(zhì)保水能力的增加，引起雞肉的水分含量上升[27-28]；在高質(zhì)量分數(shù)的食鹽中，蛋白質(zhì)發(fā)生變性會對肌肉的持水力產(chǎn)生影響；此外，較高的滲透壓使肌肉收縮，導(dǎo)致肌肉中的水分向腌制液中轉(zhuǎn)移[29]。

2.1.3 蒸煮損失率

蒸煮損失率與肉的保水性有關(guān)，可以在一定程度上反映肉的加工特性，由表1可知，食鹽添加量顯著影響雞肉的蒸煮損失率（P＜0.05），在食鹽添加量小于12%的腌制條件下，雞肉的蒸煮損失率隨著食鹽添加量的增加而降低，而在食鹽添加量為15%時，雞肉的蒸煮損失率出現(xiàn)突然的上升。NaCl可以提高肌原纖維蛋白溶解度，因此肌原纖維蛋白的水合作用以及與水的結(jié)合能力會增強，所以在食鹽添加量小于12%時雞肉的蒸煮損失率下降[27]，Villamonte等[30]也發(fā)現(xiàn)在較低食鹽添加量腌制時豬肉的蒸煮損失率隨NaCl添加量的增加而降低；而在高食鹽添加量時，肌原纖維蛋白會發(fā)生更為嚴重變性和聚集，蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用增強，產(chǎn)生“鹽析”效應(yīng)，導(dǎo)致水合作用以及與水的結(jié)合能力下降，蒸煮損失率增大[31]。

2.1.4 色澤

從表1可知，食鹽添加量顯著影響雞肉的L*、a*和b*（P＜0.05），這與Holownia[32]和Fernández[33]等的研究類似。隨著食鹽添加量的增加，L*整體呈現(xiàn)下降趨勢，說明食鹽可以顯著降低雞肉的L*，這可能與NaCl促進肌紅蛋白氧化生成褐色的高鐵肌紅蛋白有關(guān)[34]。與未添加食鹽的雞肉相比，添加食鹽可以顯著增加雞肉的a*，但食鹽添加量對雞肉a*的影響并不顯著。a*的增加可能與肌原纖維蛋白的溶解度增加有關(guān)，NaCl促進肌原纖維蛋白的溶解，導(dǎo)致肌原纖維蛋白與亞鐵血紅素反應(yīng)，使肉的a*上升[35]。此外，由表1可知，在食鹽添加量為3%時，雞肉的b*最高。

2.2 質(zhì)構(gòu)特性的變化

由圖1可知，雞肉的硬度、彈性和黏著性均受到食鹽添加量的影響，隨著食鹽添加量的增加，雞肉的硬度和彈性顯著上升（P＜0.05），而黏著性則顯著下降（P＜0.05）。這可能是雞肉表面食鹽添加量的差異引起，高食鹽添加量腌制的雞肉在其表面具有較高的鹽添加量，導(dǎo)致更嚴重的蛋白質(zhì)變性與交聯(lián)，造成保水性降低，使產(chǎn)品質(zhì)地較硬，在質(zhì)構(gòu)分析中得出較高的值。NaCl對蛋白酶的水解活性有抑制作用，所以在食鹽添加量較少時，蛋白酶的活性較強使肌肉被水解，導(dǎo)致肉的質(zhì)地柔軟；而在高添加量食鹽的滲透壓作用下，蛋白酶活性被抑制，肉的硬度會上升。除此之外，高鹽濃度下肌肉收縮和水分流失也可能會對雞肉的硬度、彈性和黏著性造成影響。Ros-Polski等[34]同樣也發(fā)現(xiàn)雞肉的硬度和彈性隨著食鹽添加量的增加而增大。相似的結(jié)論也出現(xiàn)在鴨肉腌制過程中，Du Lei等[23]也發(fā)現(xiàn)腌制時食鹽添加量增加會增大鴨肉的硬度和彈性，降低鴨肉黏著性。

圖1 食鹽添加量對雞肉質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig. 1 Effect of different NaCl levels on texture characteristics of chicken meat

2.3 TBARS值的變化

從圖2可以看出，食鹽添加量對TBARS值影響顯著（P＜0.05），與未添加食鹽的腌制組相比，添加食鹽后雞肉的TBARS值顯著較高，這表明食鹽對脂質(zhì)氧化有促進作用；有研究[14-18]也發(fā)現(xiàn)NaCl對脂質(zhì)氧化有促進作用。目前部分研究將食鹽促進脂質(zhì)氧化可能的機理歸因于如下4 種[1,3]：1）NaCl可以破壞細胞膜完整性，促進氧化劑進入脂質(zhì)底物；2）NaC l促進含鐵分子中鐵離子的釋放，加速氧化循環(huán)，如血紅素蛋白；3）NaCl抑制過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶等內(nèi)源性抗氧化酶的活性；4）食鹽中存在痕量的氧化性重金屬污染物。在本實驗中，隨著食鹽添加量的增加，TBARS值先增大后減小，在食鹽添加量為9%達到最大值（0.33 mg/kg）。在食鹽添加量為12%和15%的腌制液中，食鹽對脂質(zhì)氧化的促進作用減弱，這種現(xiàn)象可能是由于氧在高離子強度溶液中溶解度降低，造成ROS數(shù)量減少[36]。

圖2 食鹽添加量對雞肉TBARS值的影響Fig. 2 Effect of different NaCl levels on TBARS of chicken meat

2.4 蛋白質(zhì)溶解度的變化

圖3 食鹽添加量對總蛋白溶解度（A）、肌原纖維蛋白溶解度（BB）和肌漿蛋白溶解度（C）的影響Fig. 3 Effects of different NaCl levels on total protein solubility (A),myo fibrillar protein solubility (B) and sarcoplasmic protein solubility (C)

由圖3可知，食鹽添 加量顯著影響雞肉的蛋白質(zhì)溶解度（P＜0.05），其中影響最大的為肌原纖維蛋白。肌漿蛋白是水溶性蛋白，其溶解度受食鹽添加量影響較小；肌原纖維蛋白是鹽溶性蛋白，隨著食鹽添加量的增加，肌原纖維蛋白溶解度整體上呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當食鹽添加量較少時，由于“鹽溶”效應(yīng)，蛋白質(zhì)與NaCl之間的靜電相互作用阻止了蛋白質(zhì)的凝聚和沉淀，蛋白質(zhì)的溶解度會上升[37]。然而，食鹽添加量進一步升高，大量帶負電荷的氯離子與帶正電荷的蛋白質(zhì)分子相互作用，導(dǎo)致靜電斥力降低，疏水相互作用增強，此時溶質(zhì)-溶質(zhì)反應(yīng)強于溶質(zhì)-溶液反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀和溶解度下降[38]。

2.5 羰基、巰基和表面疏水性的變化

圖4 食鹽添加量對肌原纖維蛋白和肌漿蛋白羰基含量（AA）、巰基含量（B）和表面疏水性（C）的影響Fig. 4 Effects of different NaCl levels on carbonyl content (A),sulfhydryl content (B) and surface hydrophobicity (C) of myo fibrillar protein and sarcoplasmic protein

蛋白質(zhì)容易受到ROS的攻擊，使氨基酸殘基羰基化并形成交聯(lián)。這些氧化修飾使蛋白質(zhì)失去巰基、形成羰基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚合和聚集，改變蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，從而改變蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，如表面疏水性[39-40]。所以羰基含量、巰基含量、表面疏水性和蛋白質(zhì)的裂解與交聯(lián)聚合程度等都可以作為蛋白質(zhì)氧化的評估指標[41]。從圖4可以看出，在復(fù)雜的肉類體系中，不添加食鹽和較低食鹽添加量（0%、3%和6%）對蛋白質(zhì)的羰基含量、巰基含量及表面疏水性的影響差異并不顯著（P＞0. 05），而在高食鹽添加量（9%、12%和15%）的腌制條件下，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的羰基含量和表面疏水性顯著上升（P＜0.05），而巰基含量顯著下降（P＜0.05）。

蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)氧 化最顯著的改變和直接氧化攻擊的主要來源[5,42]，圖4A中羰基含量隨著食鹽添加量的增加顯著上升（P＜0.05），當食鹽添加量為15%時，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的羰基含量都達到最大值，分別為1.16 nmol/mg和1.61 nmol/mg，表明高鹽腌制對蛋白質(zhì)羰基化有顯著的促進作用。Feng Xianchao等[43]的研究也發(fā)現(xiàn)NaCl濃度越高，蛋白質(zhì)表面的賴氨酸殘基ε-NH2更易受到攻擊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基含量上升。

相反地，隨著食鹽添加量的增大，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的巰基含量顯著下降（P＜0.05），在食鹽添加量為15%達到最小值，分別為25.22 nmol/mg和25.36 nmol/mg。蛋白質(zhì)富含豐富的巰基，易受ROS的攻擊形成分子內(nèi)和分子間二硫鍵[40,44]。在較高的食鹽添加量中，肌肉的溶脹暴露出更多的位點使自由基與蛋白質(zhì)表面的巰基更容易結(jié)合，導(dǎo)致巰基含量下降（圖4B）[45]。

從圖4C可知，蛋白質(zhì)表面疏水性隨著食鹽添加量的增加顯著增加（P＜0.05），食鹽添加量為9%、12%和15%時，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白表面疏水性顯著高于食鹽添加量為0%、3%和6%。蛋白質(zhì)表面疏水性反映了蛋白質(zhì)的展開程度，是與蛋白質(zhì)功能特性相關(guān)的重要分子特性。圖4表明高濃度的食鹽腌制可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變和氨基酸的氧化修飾，使肌原纖維蛋白展開而暴露出蛋白表面的非極性氨基酸，引起表面疏水性的增加[1]。

綜上所述，食鹽添加量的增加會促進蛋白質(zhì)的氧化，這可能與食鹽對脂質(zhì)的促氧化作用有關(guān)。結(jié)合圖2與圖4的結(jié)果可知，食鹽的增加使脂質(zhì)氧化的次級產(chǎn)物（丙二醛）顯著增加，而脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的過氧化氫自由基易被蛋白質(zhì)中的氫原子吸收，形成蛋白質(zhì)自由基，并轉(zhuǎn)化為有助于烷氧自由基和羥基衍生物生成的烷氧基過氧化物[8]。同外，脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的次級產(chǎn)物（醛類化合物）易與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化[9-10]。Soladoye等[46]的研究還發(fā)現(xiàn)NaCl可能參與Fe從Fe2+到Fe3+的氧化循環(huán)，并因此促進過度金屬元素參與類似于“芬頓反應(yīng)”的化學反應(yīng)，導(dǎo)致更多的ROS自由基產(chǎn)生。

2.6 SDS-PAGE分析

肌原纖維蛋白主要包含肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白和少量尚不明了的調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)蛋白。在不添加β-巰基乙醇的條件下（非還原條件，圖5A），肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和原肌球蛋白條帶隨著食鹽添加量的增加逐漸變淺，且濃縮膠頂部的聚集物逐漸增多，說明NaCl可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)的生成。在添加β-巰基乙醇后（還原條件，圖5B），濃縮膠頂部的聚集物隨著食鹽添加量的增加明顯減少，產(chǎn)生交聯(lián)的得以還原，表明肌球蛋白主要是通過分子間二硫鍵進行交聯(lián)。

圖5 不同食鹽添加量腌制后肌原纖維蛋白的SDS-PAAGGEE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE patterns of myo fibrillar proteins in chicken meat cured with different NaCl levels

圖6 不同食鹽添加量腌制后肌漿蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 6 SDS-PAGE patterns of sarcoplasmic proteins in chicken meat cured with different NaCl levels

肌漿蛋白是水溶性蛋白，包含糖酵解途徑的大部分酶、肌酸激酶和肌紅蛋白等[47]。由圖6可知，在雞肉肌漿蛋白電泳條帶中主要包括糖原磷酸化酶b、丙酮酸激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、肌酸激酶、醛縮酶、甘油醛磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶、三磷酸異構(gòu)酶和肌紅蛋白等。與肌原纖維蛋白類似，在不含有β-巰基乙醇的情況下（非還原條件，圖6A），肌漿蛋白的條帶濃度隨著食鹽添加量的增加逐漸減弱，并且在濃縮膠頂部以及較高分子質(zhì)量區(qū)域有聚集物生成，這說明食鹽可能會引起肌漿蛋白交聯(lián)的發(fā)生。在β-巰基乙醇存在的條件下（還原條件，圖6B），部分消失的肌漿蛋白組分可以復(fù)原，表明這些組分主要是通過二硫鍵產(chǎn)生蛋白質(zhì)交聯(lián)。此外，在還原條件下，肌漿蛋白條帶隨著食鹽添加量的增加而變淡，表明高添加量食鹽可能使肌漿蛋白發(fā)生降解。

由圖6可知，高添加量的食鹽能促進肌原纖維蛋白和肌漿蛋白以二硫鍵的方式形成分子間交聯(lián)，這從側(cè)面證實高食鹽添加量的腌制過程可能會引起肌肉中蛋白質(zhì)的氧化修飾，導(dǎo)致羰基含量和表面疏水性上升，巰基含量下降（圖4）。

3 結(jié) 論

食鹽添加量的增加對雞肉的脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化有明顯促進作用（P＜0.05）。隨著食鹽添加量的增加，TBARS值基本呈現(xiàn)上升趨勢，雞肉蛋白質(zhì)的羰基含量和表面疏水性增大，蛋白質(zhì)溶解度先增大后減小，根據(jù)SDS-PAGE圖譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于食鹽的添加，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白均發(fā)生不同程度的氧化，且主要以二硫鍵的形式形成交聯(lián)。同時，食鹽添加量的改變對雞肉的食用品質(zhì)影響顯著（P＜0.05）。隨著食鹽添加量的增加，水分含量和蒸煮損失率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，雞肉的pH值和L*呈下降趨勢，食鹽的添加會顯著增大雞肉的a*，但食鹽添加量的改變沒有對a*產(chǎn)生顯著影響。綜上所述，食鹽添加量的增加會促進雞肉腌制過程中的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化，并且對雞肉的食用品質(zhì)產(chǎn)生影響。