黃巧 翟思佳 廖行偉 劉宇超 尹時華

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧530007)

MD是以反復(fù)發(fā)作性眩暈、波動性聽力下降為臨床特征，伴有耳鳴和耳脹滿感的內(nèi)耳疾病。它的基本病理表現(xiàn)為內(nèi)淋巴積水，與內(nèi)淋巴分泌和重吸收失衡有關(guān)。隨著生物信息學(xué)發(fā)展，越來越多學(xué)者研究疾病與多個基因間的聯(lián)系。MD的基因?qū)W研究也逐漸深入，孫瑩基于RNA-seq技術(shù)研究表明，免疫因素可能影響梅尼埃病的發(fā)病過程[1]。本研究檢索GEO數(shù)據(jù)庫中MD患者相關(guān)基因表達譜，鑒定差異基因及分析差異基因的功能及信號通路，探索MD的發(fā)病機制，并通過cMAP數(shù)據(jù)庫篩選潛在治療MD的小分子化合物，為深入研究MD的治療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以“Meniere's disease”為檢索詞，在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫進行搜索，獲得GSE109558數(shù)據(jù)集。

1.2 方法

利用GEO數(shù)據(jù)庫在線分析工具GEO2R，根據(jù)差異基因的條件：P＜0.05，|LogFC|≥1.5篩選差異表達基因。將差異表達基因上傳至DAVID6.8數(shù)據(jù)庫，進行在線分析基因本體(Gene Ontology,GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析。通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得PPI數(shù)據(jù)，并利用Cytoscape3.7軟件進行網(wǎng)絡(luò)互作圖構(gòu)建及可視化分析。最后應(yīng)用cMAP數(shù)據(jù)庫根據(jù)P＜0.05且|富集分數(shù)|＞0.9篩選可能為治療MD的潛在小分子藥物。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因

根據(jù)差異基因的條件，獲得差異基因53個，其中上調(diào)基因22個，下調(diào)基因31個。

2.2 富集分析

對差異表達基因富集分析，結(jié)果顯示GO分析富集在防御對病毒的反應(yīng)、對病毒的反應(yīng)、成肌細胞融合的負調(diào)節(jié)、蛋白水解、防御反應(yīng)、細胞外基質(zhì)拆解、骨吸收的積極調(diào)節(jié)、骨骼肌組織再生、趨化、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、MHC II類蛋白結(jié)合、MHC II類蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等生物過程，細胞定位在胞外（如表1）。KEGG顯著富集在Influenza A（如圖1）和Herpes simplex infection兩個途徑（如圖2）。

表1 GO分析Table 1 GO analysis

圖1 Influenza A信號傳導(dǎo)通路示意圖（標(biāo)注五星的位置為本研究中蛋白）Fig.1 Schematic map of the Influenza A(the location of the five stars is the protein in this study)

圖2 Herpes simplex infection信號傳導(dǎo)通路示意圖（標(biāo)注五星的位置為本研究中蛋白）Fig.2 Schematic map of the Herpes simplex infection(the location of the five stars is the protein in this study)

2.3 PPI分析

從STRING數(shù)據(jù)庫獲取得分≥0.4的PPI數(shù)據(jù)，利用Cytoscape3.7可視化分析顯示，該網(wǎng)絡(luò)由21個節(jié)點和35個邊緣組成（如圖3）。用插件CentiScaPe計算節(jié)點度，根據(jù)節(jié)點度≥5獲得8個關(guān)鍵基因，分別為CXCL10（CXC 趨化因子配體 10）、IFI44L、POTEE（POTE錨蛋白結(jié)構(gòu)域家族成員E）、IFI44（干擾素誘導(dǎo)蛋白44）、XAF1（X染色體連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1）、OAS2（2′,5′-寡聚腺苷酸合成酶）、HERC5（HECT類E3連接酶5）、EIF2AK2（蛋白激酶PKR）（如表2）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析（紅色節(jié)點代表上調(diào)差異基因，綠色節(jié)點代表下調(diào)差異基因；節(jié)點大小與節(jié)點度正相關(guān)，節(jié)點度越大節(jié)點的形狀越大。）Fig.3 The PPI network analysis(Red nodes correspond to upregulated genes and green nodes correspond to down-regulated genes.Node size is positively correlated with node degree,the higher the degree value,the bigger the node size is.)

表2 8個關(guān)鍵基因Table 2 The eight key genes

2.4 藥物篩選

將53個差異表達基因映射到cMAP數(shù)據(jù)庫，總共獲得33個相關(guān)小分子藥物，根據(jù)enrichment篩選出前10個負性相關(guān)且P＜0.05的小分子藥物（如表3）。經(jīng)查閱文獻，這十個小分子藥物的機理作用見表4。

3 討論

MD是常見的內(nèi)耳疾病，其病因復(fù)雜至今尚未明確。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MD的基因?qū)W及免疫學(xué)研究備受關(guān)注，許多基因被證實與MD有關(guān)，如人類組織相容性白細胞抗原(HLA)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，部分MD患者的促炎細胞因子水平升高，并且可能具有自身炎癥性內(nèi)耳疾病，某些過敏原可能誘發(fā)內(nèi)淋巴積水[3]。內(nèi)淋巴囊具有免疫調(diào)節(jié)功能，梅尼埃病的機制可能與免疫反應(yīng)引起的內(nèi)淋巴分泌和重吸收失衡有關(guān)，且臨床上免疫抑制劑治療梅尼埃病具有良好效果，因此，免疫因素可能是梅尼埃病的病因之一[4]。本研究通過生物信息學(xué)方法從MD患者外周單核細胞篩選出的8個核心基因多與免疫學(xué)相關(guān)，其中CXCL10、IFI44L、IFI44、XAF1、OAS2、HERC5、EIF2AK2為上調(diào)基因，POTEE為下調(diào)基因。

表3 cMAP數(shù)據(jù)庫篩選出的前10個小分子藥物Table 3 Top ten small molecule drugs screened from cMAP database

CXCL10為CXC家族趨化因子，是免疫學(xué)標(biāo)志物。研究表明CXCL10在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕血清中表達升高，且可能提示與疾病活動有關(guān)[5,6]。IFI44L與IFI44為干擾素（IFN）I型誘導(dǎo)基因，參與IFN誘導(dǎo)的多種生物學(xué)功能，通過抑制病毒復(fù)制，激活自然殺傷細胞，促進樹突狀細胞的產(chǎn)生和活化以及增強抗體反應(yīng)，在先天免疫中起重要作用[7]。XAF1為凋亡抑制蛋白（XIAP）的拮抗蛋白，它的表達水平與凋亡呈正相關(guān)，通過激活凋亡通路途徑促進癌細胞凋亡，有望成為治療癌癥的理想基因靶標(biāo)。12號染色體上的寡聚腺苷酸合成酶（OAS）基因包含有3個基因（OAS1，OAS2，OAS3），編碼2'-5'OAS酶，在對病毒的先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[8]。ISG15是一種非?？焖僬T導(dǎo)的IFN刺激基因，HERC5是ISG15的主要E3酶，已被證明具有抗甲型流感病毒的抗病毒活性，其能通過泛素化反應(yīng)清除細胞局部無效蛋白分子，促進IFN效應(yīng)基因的表達[9]。EIF2AK2也稱蛋白激酶PKR，其廣泛調(diào)節(jié)炎性體激活，如Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥體，PKR失活將嚴重損害炎癥小體激活，因此可能通過該分子藥理學(xué)靶向治療炎癥[10]。本研究篩選出的上調(diào)核心基因多在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕中表達水平升高，且提示與疾病活動有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，MD患者中系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病率升高，這提示MD可能與自身免疫性疾病相關(guān)。POTE被稱為癌抗原，在許多癌癥中表達，以及極少數(shù)正常組織如前列腺，卵巢和睪丸。到目前為止，POTEE確定為主要表達的POTE旁系同源物。Vekariya等[11]首次報告POTEE在免疫細胞中的表達，特別是在巨噬細胞中特異性表達，而不是在單核細胞或T細胞，且參與細胞存活，此外，在腫瘤相關(guān)巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)升高的POTEE還通過活化mTORC2表現(xiàn)出增強的細胞侵襲性。因此，本研究篩選出的8個核心基因可能通過免疫反應(yīng)在MD發(fā)病機制中起重要作用，但仍需進一步實驗驗證。

通過對差異基因GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因富集在防御對病毒的反應(yīng)、對病毒的反應(yīng)、成肌細胞融合的負調(diào)節(jié)、蛋白水解、防御反應(yīng)、趨化、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、MHC II類蛋白結(jié)合、MHC II類蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等生物過程，細胞定位在胞外。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要Influenza A和Herpes simplex infection兩個途徑。與前期研究結(jié)果一致，眾多細胞生物學(xué)過程、信號通路都與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[1]，提示MD可能具有自身炎癥性內(nèi)耳疾病。

此外，本研究通過cMAP篩選出前十個關(guān)聯(lián)度最大的負性相關(guān)小分子藥物。賴諾普利為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，間接通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)靶向鹽皮質(zhì)激素受體（MR）。MR與GR在內(nèi)耳中均有表達。糖皮質(zhì)激素廣泛用于治療內(nèi)耳疾病，其不僅通過GR介導(dǎo)，還通過MR介導(dǎo)[12]。因此，賴諾普利有可能通過靶向MR調(diào)節(jié)鈉、鉀和其他離子的平衡達到治療MD的目的，目前尚未有研究該藥物用于治療內(nèi)耳疾病。異卡波肼單胺氧化酶A/B型抑制劑，用于抗抑郁。MD患者常受眩暈、耳鳴困擾，給患者造成極大的心理負擔(dān)，抗抑郁藥可作為其輔助治療。柚皮素為免疫調(diào)劑，不僅能提高抗腫瘤免疫反應(yīng)，還能緩解自身免疫疾病的過度活化狀態(tài)[13]。伏立諾他為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，臨床上已被用作抗癌藥物，并具有免疫抑制特性。使用免疫療法的MD患者眩暈發(fā)作的持續(xù)時間和頻率有所改善[3]，因此，使用免疫療法作為控制眩暈發(fā)作的治療計劃的一部分應(yīng)該被考慮到，柚皮素與伏立諾他將有可能用于MD的免疫治療。哌侖西平為選擇性抗膽堿能藥，乙酰膽堿是橄欖耳蝸傳出系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，為耳蝸毛細胞和感覺神經(jīng)元提供反饋，毒蕈堿受體拮抗劑可增強內(nèi)耳對噪聲誘導(dǎo)的聽力損失的抵抗力。饒秀麗等[14]通過制造反復(fù)眩暈?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)毒蕈堿受體M2、M3亞型在前庭內(nèi)側(cè)核表達增加，而MD是否也存在毒蕈堿受體表達增加，抗膽堿藥是否能通過降低毒蕈堿受體表達改善MD病癥狀？炔諾酮有較強的孕激素作用，可以對抗雌激素，并增加雌激素的代謝。絕經(jīng)前后女性體內(nèi)的性激素分泌減少，導(dǎo)致出現(xiàn)植物神經(jīng)功能紊亂等問題，在某種程度上影響著女性MD的發(fā)生與發(fā)展。激素替代療法可能在一定程度上可以減緩女性MD的臨床癥狀。阿司匹林為抗血小板凝集劑，臨床病例分析發(fā)現(xiàn)阿司匹林作為聯(lián)合用藥用于短暫性腦缺血發(fā)作性眩暈[15,16]和偏頭痛性眩暈[17,18]的治療，可減少眩暈發(fā)作程度及頻率，改善患者生活質(zhì)量。昂丹司瓊5-HT3受體拮抗劑，臨床上用于止吐，可用于MD發(fā)作時出現(xiàn)的惡心嘔吐。上述篩選的小分子藥物，如賴諾普利、柚皮素、伏立諾他等有可能成為MD的治療或者輔助藥物。

表4 選出的前十個小分子藥物的機理作用Table 4 The mechanism of top ten small molecule drugs

總之，本研究通過生物信息學(xué)方法得出MD可能與自身免疫性疾病相關(guān)，使用抗組胺藥或免疫療法應(yīng)該作為控制眩暈發(fā)作治療計劃的一部分，篩選出的基因可能成為梅尼埃病潛在生物標(biāo)記物，篩選的小分子藥物有可能成為MD的治療或者輔助藥物，為MD的病因?qū)W研究及治療提供依據(jù)，但仍需進一步深入研究。