產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌藥敏性和耐藥基因表型分析

鄧明惠，候 軒，張 微，王 輝，辜依海

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬三二〇一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西漢中 723000)

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染中臨床分離的最常見病原菌之一[1-2]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床分離的肺炎克雷伯菌耐藥性也越來越強(qiáng)，肺炎克雷伯菌在人體和外界環(huán)境中具有較強(qiáng)的生存能力，這使其成為導(dǎo)致社區(qū)獲得性感染的主要病原菌之一[3]。有研究表明，社區(qū)獲得性肺炎克雷伯菌感染導(dǎo)致的病死率高于醫(yī)院獲得性肺炎克雷伯菌感染導(dǎo)致的病死率，且近年來社區(qū)獲得性肺炎克雷伯菌感染患者數(shù)量及感染患者的基因類型逐漸增多，患病程度也越來越嚴(yán)重[4]，因此，社區(qū)獲得性感染也逐漸受到臨床醫(yī)生的高度重視。本研究收集本院各臨床科室感染患者送檢的各類標(biāo)本中分離培養(yǎng)的產(chǎn)超廣譜-β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌菌株，檢測(cè)其耐藥性及ESBLs的基因表型，比較社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院獲得性感染菌株之間的差異，指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物，并預(yù)防耐藥菌株的傳播。

1 資料與方法

1.1菌株來源 共收集2016年1月至2018年6月95株本院臨床科室送檢標(biāo)本中分離培養(yǎng)出的產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌。因留菌污染等原因，經(jīng)再次鑒定后，剔除14株菌株，剩余81株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌，其中來自痰液標(biāo)本56株，血液標(biāo)本17株，尿液標(biāo)本4株，分泌物標(biāo)本3株，腦脊液標(biāo)本1株。根據(jù)患者入院時(shí)間將81株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌分為社區(qū)獲得性感染及醫(yī)院獲得性感染，即患者入院48 h之內(nèi)采集標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，并且患者在3個(gè)月內(nèi)未到過醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診或服用抗菌藥物則劃分為社區(qū)獲得性感染，反之則劃分為醫(yī)院獲得性感染。

1.2方法

1.2.1菌種鑒定 革蘭染色：用接種環(huán)取1滴生理鹽水滴在玻片上，用接種針取MH瓊脂平板上已分純的新鮮菌落，在生理鹽水中涂勻，放烘箱中，待烘干后經(jīng)酒精燈外焰固定，再進(jìn)行革蘭染色。加結(jié)晶紫液染1 min，用清水沖去染液瀝干；加碘液染1 min，清水沖洗后瀝干；再加脫色液，輕輕搖動(dòng)10～30 s，至無紫色脫落為止，清水沖洗后瀝干；最后加入復(fù)染液，約30 s，清水沖洗后放入烘箱，烘干后鏡檢。

1.2.2留菌判讀依據(jù) 肺炎克雷伯菌為革蘭陰性、較短粗的桿菌，大小(0.5～0.8)μm×(1～2)μm，單獨(dú)、成雙或短鏈狀排列。無芽孢，無鞭毛，患者標(biāo)本直接涂片或在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基上可見菌體外有明顯的莢膜，多數(shù)有菌毛。在初次分離培養(yǎng)基上可形成較大、凸起、灰白色、黏液菌落。菌落大而厚實(shí)、光亮、濕潤(rùn)，相鄰近菌落易融合，以接種針蘸取時(shí)可拉出細(xì)絲，在中國(guó)藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱培養(yǎng)基上能發(fā)酵乳糖，并產(chǎn)酸，形成黏液型較大的有色菌落。

1.2.3質(zhì)控菌株 陰性質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922和陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎克雷伯菌ATCC70060均購(gòu)自陜西省臨床檢驗(yàn)中心。

1.2.4紙片擴(kuò)散(K-B)法 對(duì)臨床收集并鑒定為肺炎克雷伯菌的菌株采用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，所用藥敏紙片包括氨芐西林、哌拉西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、頭孢西丁、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、替加環(huán)素、米諾環(huán)素、多黏菌素E 21種抗菌藥物，均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。耐藥折點(diǎn)的判讀及產(chǎn)ESBLs確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)參照2013年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2.5肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs確認(rèn)試驗(yàn) 使用到的材料及工具包括配制好的MH瓊脂平板、分純的單克隆菌落、無菌鑷子、無菌生理鹽水、無菌棉簽、抗菌藥物藥敏紙片。將細(xì)菌傳種于MH瓊脂平板上，并分區(qū)劃線，放入35 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育18～24 h，挑取單克隆菌株，并調(diào)制菌懸液至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，用無菌棉簽蘸取適量菌液均勻涂布于MH平板上，室溫放置5 min后貼抗菌藥物紙片。將頭孢噻肟(30 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(30/10 μg)、頭孢他啶(30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(30/10 μg)藥敏紙片貼于MH瓊脂平板上，兩紙片間距離為25 mm，然后將貼好的MH瓊脂平板置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜后判讀結(jié)果。

1.2.6耐藥基因的檢測(cè) 細(xì)菌DNA模板的制備：從低溫冰箱中取出保存菌株，用接種環(huán)傳種到血瓊脂培養(yǎng)基上，然后快速將菌株放回低溫冰箱，避免菌株反復(fù)凍融。在EP管中先加入2 mL雙蒸水，再刮取3～5個(gè)已培養(yǎng)18～24 h的新鮮菌落置于EP管中，用移液槍輕輕混勻，置于沸水中煮10 min，再放置于離心機(jī)中(4 ℃，12 000 r/min)離心2 min，上清液即為粗提DNA模板，用移液槍吸取上清液至無菌的EP管中，保存于-20 ℃冰箱備用。PCR擴(kuò)增篩選的耐藥基因包括blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV，所用引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1，引物均由西安擎科生物有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間中的兩組比較采用Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1生化鑒定 95株細(xì)菌中有81株鑒定為肺炎克雷伯菌，即三糖鐵試驗(yàn)陽(yáng)性，蛋白胨水試驗(yàn)陰性，枸櫞酸試驗(yàn)陽(yáng)性，尿素試驗(yàn)陽(yáng)性，經(jīng)API20E鑒定結(jié)果符合率為99.8%。

2.2肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)鑒定為肺炎克雷伯菌的81株菌進(jìn)行了21種抗菌藥物的藥敏檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些菌株表現(xiàn)出了較高的耐藥性，見表2。對(duì)于氨芐西林耐藥率高達(dá)98.8%；但是對(duì)含抑制劑藥物耐藥率卻有了明顯的下降，如阿莫西林/克拉維酸(39.5%)、氨芐西林/舒巴坦(63.0%)、哌拉西林/他唑巴坦(2.5%)；對(duì)第一、二、三代頭孢菌素藥物的敏感情況也不理想，頭孢呋辛敏感率為11.1%，頭孢噻肟敏感率為3.7%，頭孢他啶也僅有33.3%，而對(duì)第四代頭孢菌素頭孢吡肟耐藥率為21.0%；所有菌株均對(duì)美羅培南、亞胺培南表現(xiàn)為較敏感，沒有出現(xiàn)對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的菌株；對(duì)多黏菌素E敏感率為100.0%，對(duì)替加環(huán)素敏感率為93.8%，是僅次于碳青霉烯類藥物及多黏菌素E敏感性較好的藥物，氨基糖苷類藥物中，對(duì)慶大霉素出現(xiàn)了72.8%的耐藥率，但是對(duì)阿米卡星的敏感性較好，達(dá)到了82.7%；對(duì)其他藥物如環(huán)丙沙星、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑等均表現(xiàn)出了較高的耐藥率。

表2 81株肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

2.3社區(qū)獲得性感染與醫(yī)院獲得性感染菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較 44株社區(qū)獲得性感染菌株和37株醫(yī)院獲性感染菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥率見表3。44株社區(qū)獲得性感染菌株和37株醫(yī)院獲得性感染菌株的藥敏結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 社區(qū)獲得性感染與醫(yī)院獲得性感染菌株 藥敏試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.4產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥基因型 過PCR擴(kuò)增測(cè)序的方法獲得產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥基因型，擴(kuò)增的基因型包括CTX-M-1、CTX-M-9、TEM、SHV，發(fā)現(xiàn)81株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌均檢出ESBLs基因，其中TEM基因型陽(yáng)性41株(50.62%)，SHV基因型陽(yáng)性79株(97.53%)，CTX-M陽(yáng)性51株(62.96%)，CTX-M-1基因型陽(yáng)性29株(35.80%)，CTX-M-9基因型陽(yáng)性26株(32.10%)，4株同時(shí)CTX-M-1與CTX-M-9基因型陽(yáng)性。除16株攜帶單獨(dú)ESBLs基因外(社區(qū)獲得性感染7株，醫(yī)院獲得性感染9株)，其余的菌株均包含兩種以上ESBLs基因，有36株細(xì)菌同時(shí)攜帶兩種耐藥基因(44.44%)，有24株細(xì)菌攜帶3種以上耐藥基因(29.63%)。根據(jù)測(cè)序及結(jié)果比對(duì)，TEM陽(yáng)性菌株全部為TEM-1基因型，SHV基因型陽(yáng)性為SHV1和SHV11型，CTX-M型菌株均產(chǎn)ESBLs。81株細(xì)菌中，SHV基因型的檢出率最高，CTX-M+SHV基因型為60.49%，耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見表4。

將37株醫(yī)院獲得性感染菌與44株社區(qū)獲得性感染菌的耐藥基因表型進(jìn)行比較，社區(qū)獲得性感染菌在TEM、SHV、CTX-M-9基因型中陽(yáng)性株均多于醫(yī)院獲得性感染菌株。在耐藥基因陽(yáng)性株的比例上，CTX-M-9在社區(qū)獲得性感染菌中的攜帶率高于醫(yī)院獲得性感染菌攜帶率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他的ESBLs基因型，如CTX-M-1、SHV、TEM基因型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表4 肺炎克雷伯菌的耐藥基因型

表5 社區(qū)與醫(yī)院獲得性肺炎克雷伯菌感染菌耐藥基因型比較(n)

3 討 論

肺炎克雷伯菌已成為社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染中的重要病原菌，多重耐藥的產(chǎn)生和傳播給臨床治療帶來了很大的困難[5]，并且產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌可以經(jīng)過傳導(dǎo)和整合等方式將耐藥質(zhì)粒傳遞給其他細(xì)菌，導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象更加嚴(yán)重[6-7]。本研究對(duì)81株肺炎克雷伯菌進(jìn)行了21種抗菌藥物的藥敏檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青霉素類藥物已不適合臨床治療肺炎克雷伯菌引起的感染，而β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對(duì)于抑制菌株耐藥起到了明顯的作用。肺炎克雷伯菌對(duì)慶大霉素出現(xiàn)了72.8%的耐藥率，對(duì)其他藥物如環(huán)丙沙星、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑等均表現(xiàn)了較高的耐藥率。值得慶幸的是，在本地區(qū)，還沒有出現(xiàn)耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，由此可見，美羅培南、亞胺培南、多黏菌素E、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦是目前本院治療肺炎克雷伯菌感染的最有效藥物[8]。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，社區(qū)獲得性感染菌株在對(duì)抗菌藥物的耐藥率上應(yīng)該低于醫(yī)院獲得性感染菌株，其原因主要為醫(yī)院獲得性感染菌株面臨的抗菌藥物選擇壓力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于社區(qū)獲得性感染菌株，也更容易進(jìn)化成多重耐藥菌[9]。但是本研究數(shù)據(jù)顯示，社區(qū)獲得性感染菌株除對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑這5種抗菌藥物的耐藥率比醫(yī)院獲得性感染菌株耐藥率低9.7%～20.3%外，兩者對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均比較接近，甚至有個(gè)別藥物如哌拉西林、頭孢呋辛等社區(qū)獲得性感染菌株耐藥率還略高于醫(yī)院獲得性感染菌株。由此看來，社區(qū)獲得性感染菌株很可能會(huì)和醫(yī)院獲得性感染菌株有傳播上的交叉，所以并不能認(rèn)為社區(qū)獲得性感染菌株只在院外流行，同時(shí)，這些菌株獲得外源耐藥基因的能力并不差于醫(yī)院獲得性感染菌株，故造成社區(qū)獲得性感染菌株表現(xiàn)出的高耐藥性接近甚至超過了醫(yī)院獲得性感染菌株。

產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌引起的感染也在世界各地廣泛流行[10]。由于抗菌藥物使用觀念和策略差異及細(xì)菌對(duì)不同抗菌藥物的選擇性壓力不同，ESBLs流行類型在不同的國(guó)家和不同地區(qū)也有所不同[11]。有報(bào)道顯示，在北美及西歐地區(qū)主要流行TEM型 和SHV型，而在東歐地區(qū)、亞洲地區(qū)和南美地區(qū)多流行CTX-M 型[12-14]。同樣，在我國(guó)的不同地區(qū)，報(bào)道的優(yōu)勢(shì)ESBLs基因型也不完全相同，廣東地區(qū)主要以CTX-M型為主，而TEM 型則在山西地區(qū)較常見[15]。而本研究在對(duì)81株產(chǎn)ESBLs的菌株進(jìn)行常見的ESBLs基因篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論是社區(qū)獲得性感染菌株，還是醫(yī)院獲得性感染菌株，與以往研究報(bào)道不同的是SHV在本研究中的檢出率最高，達(dá)到了97.53%，大大超過了季淑娟等[16]研究報(bào)道的檢出率(13.24%)，同時(shí)攜帶CTX-M+SHV基因型菌株占60.49%?？傊?，本院ESBLs基因以CTX-M和SHV基因型為主。

隨著抗菌藥物的大量使用，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌菌株耐藥性逐年上升，使臨床醫(yī)生在抗感染治療中面臨著很大的困難，臨床微生物室人員應(yīng)該在日常工作中，根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)，及時(shí)準(zhǔn)確地發(fā)出報(bào)告。同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)多重耐藥菌的檢測(cè)和上報(bào)工作，并統(tǒng)計(jì)本院的病原菌及耐藥情況，制訂成冊(cè)，并聯(lián)合醫(yī)院感染科加強(qiáng)對(duì)臨床醫(yī)師進(jìn)行培訓(xùn)，讓他們能夠合理使用抗菌藥物，并重視抗菌藥物的使用和管理，醫(yī)護(hù)人員在日常操作中，應(yīng)該加強(qiáng)無菌觀念，對(duì)于攜帶多重耐藥菌株的住院患者，應(yīng)注意消毒和隔離，以防止其耐藥菌在院內(nèi)及院外的傳播和流行。在對(duì)抗菌藥物耐藥率較高的肺炎克雷伯菌中，ESBLs基因攜帶率更高，故在日常工作中，在監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性的同時(shí)，更應(yīng)加強(qiáng)ESBLs基因的檢測(cè)。

4 結(jié) 論

綜上所述，在本地區(qū)無論是產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌菌株的耐藥率，還是ESBLs耐藥基因的攜帶率，社區(qū)獲得性感染菌與醫(yī)院獲得性感染菌均比較接近。