周 翼，吳林軍，雷建東

(四川省樂山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，四川樂山 614000)

甲狀腺癌可發(fā)生于任何年齡段，高發(fā)于中青年女性。甲狀腺癌初期可在甲狀腺內(nèi)局限生長數(shù)年，可經(jīng)淋巴管擴散至其他組織，其發(fā)病受激素、遺傳易感、環(huán)境等因素影響，缺碘、放射性物質(zhì)照射、電離輻射過度、甲狀腺炎均可引起甲狀腺腫瘤[1]?；颊叱１憩F(xiàn)為頸部無痛性腫塊，少數(shù)患者會有吞咽困難癥狀。甲狀腺癌按照病理組織分型分為乳頭狀癌、髓樣癌、濾泡癌、低分化癌、未分化癌、鱗狀細(xì)胞癌，甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的類型[2]。近年來，通過檢測各種生物標(biāo)記物在腫瘤中的表達(dá)從而輔助診斷腫瘤已成為臨床研究熱點。人骨髓內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物-1(HBME-1)是內(nèi)皮細(xì)胞微絨毛表面的一種抗原，在腫瘤血管形成及生長過程中發(fā)揮重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，HBME-1在惡性間質(zhì)腫瘤中高表達(dá)[4]，推測HBME-1可在臨床輔助診斷甲狀腺乳頭狀癌時發(fā)揮重要作用。程序性死亡因子配體-1(PD-L1)是程序性死亡因子的配體，已被多項研究證實存在于多種惡性腫瘤中。有研究報道PD-L1在肺癌細(xì)胞的免疫逃逸機制中發(fā)揮重要作用，它可通過與程序性死亡因子結(jié)合，促進T細(xì)胞凋亡，從而使肺癌細(xì)胞不被殺傷[5]。但目前，對PD-L1在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)情況的研究較少。本研究通過檢測甲狀腺乳頭狀癌中HBME-1及PD-L1表達(dá)情況，探究兩種指標(biāo)對評估腫瘤進展情況的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年4月至2019年5月本院收治的甲狀腺乳頭狀癌患者102例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合甲狀腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)病理組織學(xué)檢查診斷為乳頭狀癌；(2)接受甲狀腺乳頭狀癌腫瘤切除手術(shù)；(3)年齡18～65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)良性甲狀腺腫瘤；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并免疫系統(tǒng)疾??；(4)合并感染性疾??；(5)哺乳期及妊娠期女性。通過手術(shù)切除患者病灶組織及癌旁甲狀腺正常組織，分別作為觀察組與對照組。本研究納入患者年齡26～65歲，平均(42.62±5.37)歲；男57例，女45例；已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期37例。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬對本研究內(nèi)容充分知曉，自愿簽署知情同意書。

1.2方法 對兩組甲狀腺組織進行免疫組化染色，免疫組化染色原理：以攜帶顯色劑的特異性抗體與抗原結(jié)合為理論基礎(chǔ)，觀察抗原抗體反應(yīng)復(fù)合物在細(xì)胞中的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)蛋白進行定性及定量分析[7-9]。方法：(1)將兩組病理組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化(同一患者制作兩張病理切片)，使用磷酸鹽緩沖液(PBS，上海莼試生物技術(shù)有限公司，貨號：CS-0779S)沖洗3次，每次2 min；(2)向切片中滴加3%過氧化氫溶液50 μL，室溫下放置10 min后使用PBS沖洗3次，每次2 min；(3)向切片中滴加50 μL山羊血清封閉液(愛必信上海生物科技有限公司，貨號：abs933)，室溫孵育30 min，使用PBS沖洗3次，每次2 min；(4)向切片中分別滴加PD-L1抗體(上海滬震實業(yè)有限公司，貨號：1234-00-00)、HBME-1抗體[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]，4 ℃冰箱孵育一夜后使用PBS沖洗3 min；(5)向切片中滴加50 μL酶標(biāo)鼠抗兔復(fù)合物，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次2 min；(6)向切片中滴加2滴DAB溶液(合肥康源生物科技有限公司，貨號：DAB002)染色，同時使用顯微鏡觀察，當(dāng)鏡下觀察到棕色時終止染色，自來水沖洗1 min；(7)向切片中滴加蘇木素染液(上海源葉生物科技有限公司，貨號:R20568-100 mL)復(fù)染30 min，自來水沖洗2 min；(8)使用85%、95%、100%梯度酒精分別脫水5 min，二甲苯透明5 min，中性樹脂封片，貼標(biāo)簽后顯微鏡觀察染色情況。陰性對照使用PBS代替酶標(biāo)鼠抗兔復(fù)合物。

陽性結(jié)果判斷：HBME-1定位于細(xì)胞膜，觀察到細(xì)胞膜為棕黃色或棕褐色即為陽性，PD-L1定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，觀察到細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)為棕黃色或棕褐色即為陽性。每張切片選取5個高倍鏡視野，人工計數(shù)每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)目，統(tǒng)計平均陽性細(xì)胞數(shù)。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：無任何著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)<總細(xì)胞數(shù)的30%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)>總細(xì)胞數(shù)的30%為2分。染色強度評分×陽性細(xì)胞數(shù)評分為0～<2分表示陰性，2～<4分表示弱陽性、4～6分表示強陽性[10]。陽性率=(弱陽性例數(shù)+強陽性例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.3觀察指標(biāo) (1)觀察組與對照組中PD-L1的免疫組化結(jié)果；(2)觀察組與對照組中HBME-1免疫組化結(jié)果；(3)PD-L1與HBME-1表達(dá)情況與甲狀腺乳頭狀癌一般特征的單因素分析，納入研究的因素包括年齡是否大于或等于45歲、性別、病灶大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤數(shù)量、是否侵犯包膜；(4)PD-L1、HBME-1表達(dá)情況與甲狀腺乳頭狀癌一般特征的多因素分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用配對χ2檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組PD-L1免疫組化結(jié)果比較 PD-L1在觀察組中陽性率為69.61%(71/102)，明顯高于對照組的15.69%(16/102)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=60.625，P<0.001)，見表1。觀察組PD-L1陽性細(xì)胞也較多，對照組幾乎無PD-L1陽性細(xì)胞，見圖1。

表1 兩組PD-L1免疫組化結(jié)果比較

2.2兩組HBME-1免疫組化結(jié)果比較 HBME-1在觀察組中陽性率為73.53%(75/102)，明顯高于對照組的6.86%(7/102)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=94.291，P<0.001)，見表2。免疫組化結(jié)果顯示觀察組HBME-1陽性細(xì)胞較多，對照組幾乎無HBME-1陽性細(xì)胞，見圖1。

2.3PD-L1及HBME-1表達(dá)情況與甲狀腺乳頭狀癌一般特征的單因素分析 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯包膜患者PD-L1陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯包膜患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯包膜患者HBME-1陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯包膜患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4PD-L1及HBME-1表達(dá)情況與甲狀腺乳頭狀癌影響因素的多因素分析 將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的因素納入多因素分析，結(jié)果顯示，PD-L1、HBME-1表達(dá)陽性均是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯包膜的高危因素(P<0.05)，即PD-L1、HBME-1表達(dá)陽性率越高，患者腫瘤組織發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯包膜的風(fēng)險越大，見表4。

表2 兩組HBME-1免疫組化結(jié)果比較

注：A為免疫組化染色陰性對照，無任何著色(×200)；B為HBME-1染色陽性細(xì)胞(×200)；C為HBME-1染色陰性細(xì)胞(×200)；D為PD-L1染色陽性細(xì)胞(×200)；E為PD-L1染色陰性細(xì)胞，幾乎無著色(×200)。

表3 PD-L1及HBME-1表達(dá)情況與甲狀腺乳頭狀癌影響因素的單因素分析[n(%)]

續(xù)表3 PD-L1及HBME-1表達(dá)情況與甲狀腺乳頭狀癌影響因素的單因素分析[n(%)]

表4 PD-L1及HBME-1表達(dá)情況與甲狀腺乳頭狀癌影響因素的多因素分析

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌患者早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在體檢時通過B超發(fā)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)，再通過體格檢查、病理組織學(xué)檢查進一步確診。一般甲狀腺乳頭狀癌未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，經(jīng)手術(shù)治療后10年生存率在80%以上。多數(shù)已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者不具有手術(shù)適應(yīng)證或通過手術(shù)無法完全切除腫瘤，在姑息治療后預(yù)后情況較差。早期發(fā)現(xiàn)、確診，并進行手術(shù)治療是提高甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后的重要手段。甲狀腺乳頭狀癌瘤體常為灰白色實質(zhì)瘤，一般大小在1 cm以內(nèi)；巨大甲狀腺乳頭狀癌瘤體可達(dá)到6 cm，瘤體常位于甲狀腺包膜周圍，導(dǎo)致包膜受到腫瘤侵犯[11]，其中心切面似乳頭狀，因此稱為乳頭狀腫瘤。但不是所有乳頭狀癌患者的病理標(biāo)本均為典型乳頭狀，因此，僅依靠病理檢查診斷并不適用于所有患者。隨著分子生物學(xué)及免疫組化技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷、輔助診斷中的發(fā)展，高靈敏度、高特異度的分子標(biāo)志物在輔助診斷腫瘤時的應(yīng)用價值逐漸升高[12]。將特異性分子標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤篩查中可提示早期腫瘤病變、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險等。

HBME-1本質(zhì)為一種酸性氨基酸多聚糖蛋白，常用于臨床診斷或鑒別診斷間皮細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌及乳腺癌，免疫組化中陽性表現(xiàn)為細(xì)胞膜黃染[13-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌中HBME-1表達(dá)量明顯高于良性增生的甲狀腺乳頭狀癌[16-17]，提示甲狀腺乳頭狀癌的惡性病變可能與HBME-1有關(guān)。PD-L1在多種癌癥中過表達(dá)，目前抗PD-L1藥物已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)，臨床常應(yīng)用于治療尿路轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌[18]。

本研究通過對甲狀腺乳頭狀癌患者的病灶組織、癌旁正常組織進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)觀察組中HBME-1及PD-L1陽性率明顯升高，提示HBME-1及PD-L1確實在甲狀腺乳頭狀癌組織中處于高表達(dá)狀態(tài)，其高表達(dá)可能與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。將甲狀腺乳頭狀癌患者臨床一般特征與觀察組中的HBME-1、PD-L1陽性率進行單因素分析，結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯包膜患者PD-L1陽性率明顯升高，與曹益嘉等[19]研究結(jié)果具有一致性，提示PD-L1高表達(dá)可能與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展進程有關(guān)。年齡、性別、病灶大小及腫瘤數(shù)量與PD-L1表達(dá)陽性無明顯關(guān)系，但曹益嘉等[19]研究結(jié)果還表明年齡≥45歲甲狀腺乳頭狀癌患者中的PD-L1陽性率較高，可達(dá)到79%，與本研究年齡因素研究結(jié)果不一致。分析原因可能是由于本研究納入樣本量不足，雖然≥45歲患者PD-L1陽性率可達(dá)到76.47%，但與<45歲患者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HBME-1也在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯包膜的甲狀腺乳頭狀癌患者中陽性率較高，與病灶大小、性別、腫瘤數(shù)量無明顯關(guān)系。進一步多因素分析結(jié)果顯示，PD-L1、HBME-1高表達(dá)是甲狀腺乳頭狀癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯包膜的危險因素，與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展進程密切相關(guān)，提示PD-L1、HBME-1高表達(dá)的甲狀腺乳頭狀癌患者具有高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯包膜風(fēng)險。

4 結(jié) 論

PD-L1與HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌病灶組織中過表達(dá)，兩者表達(dá)量過高與患者腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯包膜有關(guān)。PD-L1與HBME-1均可作為甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展過程中的敏感分子標(biāo)記物，可應(yīng)用于臨床輔助診斷患者病情發(fā)展，指導(dǎo)臨床選擇合適的治療方案。但由于納入樣本量有限，本研究未對PD-L1與HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌中的高表達(dá)機制進行深入研究，后續(xù)可對PD-L1與HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌中被激活的信號通路進行分析，為完善PD-L1與HBME-1在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)及其作用機制提供一定參考價值。