江燕，黎星輝，浦滇，藍增全，吳田*

基于莖材解剖結構的茶樹樹齡測定方法

江燕1，黎星輝2，浦滇3，藍增全4*，吳田1*

1. 西南林業(yè)大學國家林業(yè)與草原局西南風景園林工程技術研究中心，云南 昆明 650224；2. 南京農業(yè)大學茶葉科學研究所，江蘇 南京 210095；3. 西南林業(yè)大學生態(tài)與水土保持學院，云南 昆明 650224；4. 西南林業(yè)大學綠色發(fā)展研究院茶生態(tài)研究中心，云南 昆明 650224

以茶樹為研究對象，采用茶樹莖材切片及染色技術，在生物數(shù)碼顯微鏡的普通光和熒光下，對未處理的茶樹莖材切片、番紅染色茶樹莖材切片及吖啶橙染色茶樹莖材切片進行比較與分析。結果表明，茶樹莖材切片使用吖啶橙染色后在普通光和熒光下確定樹齡的效果較好。這種基于數(shù)字圖像確定茶樹樹齡的吖啶橙染色法，具有快速、準確、簡單和成本低等特點，對大茶樹和古茶樹活體生長錐取樣年輪條的年輪識別具有科學參考意義。

茶樹莖材切片；染色技術；熒光；年輪；數(shù)字圖像

茶樹[(L.) O. Kuntze]屬山茶科（Theaceae）山茶屬（L.），起源于我國西南地區(qū)，至今已有三千多年的栽培歷史[1]。中國茶樹種質資源豐富，特別是云南聚集著大量茶組植物（Section Thea）[2-4]，其中有許多不同類型的大茶樹。同樣，在中國、印度和東南亞的其他許多地方也都發(fā)現(xiàn)了大茶樹。由于消費市場對大樹茶和古樹茶的青睞，人們期望了解茶樹的真實樹齡。目前，茶樹樹齡的鑒定方法主要有文獻追蹤法、訪談傳說法、類推法、CT掃描法、生長錐法、Java年輪分析系統(tǒng)等方法[5-6]，這些方法各有優(yōu)缺點，基于年輪計數(shù)的樹齡判定方法得到人們的普遍認同。樹木在一個生長周期內形成的一圈木質環(huán)輪是它的年輪，年輪的形成受到自身遺傳特性和環(huán)境條件的影響[7]。樹木受到環(huán)境因素影響致使年輪寬窄不同，如春季細胞分裂速度快、體積大、細胞壁薄、材質松軟、材色較淺；秋季細胞活動逐漸減小，細胞分裂速度減慢，體積小，材色較深[8]。年輪變異主要有偽年輪或多層輪、斷輪、年輪丟失等[9]。這些年輪變異的情況會影響茶樹樹齡鑒定的準確性。

樹木細胞的特征被證實能夠提供與環(huán)境相關的重要信息[10]，年輪的分析對歷史、氣候等科學研究方面也具有重要價值[11]。年輪特征識別作為年輪分析的基礎，其識別的質量直接影響分析結果的準確性[12]，年輪早晚材的準確分割是年輪計數(shù)和間距測量的前提條件[13]。在樹木年輪的研究中，圖像處理技術被廣泛應用[14]，年輪鑒定分析手段趨于多樣化。目前常用的年輪測量方法或儀器存在著測量難度大、儀器專業(yè)性強、測量成本較高等問題。研究出一種測量精度和性價比較高的年輪分析方法對年輪研究具有積極意義[15]。根據(jù)樹木生長基本原理、樹木早晚材[16]、年輪[17]、年輪取向[18]、年輪邊界[19]等特征，應用染色技術，結合現(xiàn)代數(shù)字圖像技術分析茶樹莖材解剖結構[20]，是一條更精準識別茶樹年輪的有效途徑。

在木材解剖結構分析中通常采用番紅、固綠等進行染色，本試驗采用了生物細胞染色中用到的吖啶橙染色法[21]。使用吖啶橙（AO）核酸染料進行試驗，利用核酸染料的光譜特性[22]，使染色的莖材切片在特定光下激發(fā)出熒光，于生物數(shù)碼顯微鏡下進行莖材切片的觀察，比較分析不同染色方法識別茶樹年輪的效果，旨在為茶樹樹齡鑒定提供一種精確的科學方法。

1 材料與方法

1.1 研究地點和環(huán)境

樣本于中國茶區(qū)內采集，共涉及7個地區(qū)：西藏自治區(qū)林芝市、云南省西雙版納傣族自治州、云南省昆明市、貴州省六盤水市、四川省成都市、湖北省黃岡市、廣西省南寧市。海拔范圍為350~2?300?m，年均降水范圍為650~1?513?mm，年均氣溫范圍為8.7~22.6℃。采集地點具有一定的代表性，環(huán)境氣候類型多樣，茶樹樣本差異性較大（表1）。

1.2 試驗材料及預處理

試驗儀器：MY-12CH402AMidea高壓鍋（廣東美的生活電器制造有限公司），SM2000RLeica滑走式切片機（北京海天友誠科技有限公司），ECLIPSE80iNikon生物數(shù)碼顯微鏡及NIS-Elements BR圖像采集系統(tǒng)（上海衡浩儀器有限公司）。

試驗試劑：番紅購自福州飛凈生物科技有限公司，吖啶橙購自上海麥克林生化科技有限公司，丙三醇和二甲苯購自昆明碩陽科技有限公司，無水乙醇購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，中性樹膠購自中國上海標本模型廠。番紅染色液的配制：稱取1?g番紅粉末加50%乙醇定容至100?mL，避光保存。吖啶橙染色液的配制：取稱1?g吖啶橙粉末加蒸餾水定容至100?mL，避光保存。

本試驗中的樣本均為茶樹[(L.) O. Kuntze]，基于保護茶樹的原則，取樣時選擇已死亡的茶樹。以貴州省六盤水市茶樹樣本為例，沿茶樹基部截取樹干后取厚度約2?cm的木段（圖1-a），用80~1?200目砂紙將茶樹橫截面打磨光滑。以茶樹髓心為中心，進行四等分，長度為髓心至樹皮，寬度約8?mm的樣本，經(jīng)切割后得到4個方向的樣本（圖1-b）。

將切好的四等分茶樹樣本在高壓鍋（溫度100℃，壓力80?kPa）中純水燜煮2?h，保溫10?h，對茶樹樣本進行軟化處理。使用滑走式切片機，對軟化過的茶樹樣本從髓心至樹皮取完整的切片，切片厚度為30~40?μm，每個樣本選擇3片切片。

表1 茶樹樣本所處環(huán)境基本信息

注：a：基部茶樹樣本；b：均分的茶樹樣本

1.3 茶樹莖材切片處理

茶樹樣本切片分別做3種處理：處理一（對照）的切片不染色，使用丙三醇封片（圖2-a）；處理二的切片使用番紅染色，在番紅染色液中浸泡4?h，經(jīng)不同濃度乙醇（50%、75%、95%、100%）、二甲苯依次脫水，每步5?min，最后用中性樹膠封片，凝固后可永久保存（圖2-b）；處理三的切片使用吖啶橙染色，在吖啶橙染色液中浸泡5?min，經(jīng)不同濃度乙醇（50%、75%、95%、100%）依次脫水，每步5?min，使用丙三醇封片（圖2-c）。

考慮茶樹顯微構造分子的輪廓清晰度和所獲圖像的視野范圍，本研究中Nikon生物數(shù)碼顯微鏡的物鏡采用2~20倍，目鏡采用10倍，光照采用了普通光和熒光。Nikon生物數(shù)碼顯微鏡的熒光選擇了UV-2A檔，光照波長為330~380?μm，在此波長范圍內，年輪識別效果最佳。在NIS-Elements BR數(shù)字成像系統(tǒng)中識別茶樹莖材橫截面解剖結構，識別茶樹年輪過程中使用該數(shù)字成像系統(tǒng)拍照，圖像精度為1?280×960像素。

2 結果與分析

2.1 未染色茶樹莖材切片

以貴州省六盤水市茶樹樣本為例，未經(jīng)任何染色處理的茶樹莖材解剖切片，使用Nikon生物數(shù)碼顯微鏡4（物鏡）×10（目鏡）倍觀察。在普通光照下，莖材呈現(xiàn)出原本的顏色，可見其年輪和導管，但清晰度不夠，且受莖材切片厚度影響而未達到最佳識別效果（圖3-a）。在UV-2A熒光照射下，年輪早材管孔比晚材管孔大，可判定茶樹屬于環(huán)孔材，從早材到晚材的導管變化比較明顯，年輪界限可見（圖3-b）。所有圖中標注1的部分為早材，2為晚材，年輪界限使用黑色實心三角形標注。

2.2 番紅染色茶樹莖材切片

經(jīng)番紅染色過的茶樹莖材切片，使用Nikon生物數(shù)碼顯微鏡4（物鏡）×10（目鏡）倍，在普通光照下，切片呈現(xiàn)出紅色，可以直觀看出年輪界限和導管變化，早材、晚材過渡區(qū)可以識別（圖4-a）。在UV-2A熒光照射下，番紅染色的切片呈現(xiàn)出褐色，無法對所有年輪界限進行識別（圖4-b）。

注：a：未染色茶樹莖材切片；b：番紅染色的茶樹莖材切片；c：吖啶橙染色的茶樹莖材切片

注：a：普通光下4×10倍未染色茶樹莖材切片；b：熒光下4×10倍未染色茶樹莖材切片

注：a：普通光下4×10倍番紅染色茶樹莖材切片；b：熒光下4×10倍番紅染色茶樹莖材切片

2.3 吖啶橙染色茶樹莖材切片

經(jīng)吖啶橙染色后的茶樹莖材切片，在數(shù)字圖像識別系統(tǒng)下易于識別。其年輪、早材、晚材、導管、軸向薄壁組織、胞間道和木射線等清晰，切片顏色變?yōu)辄S綠色。使用Nikon生物數(shù)碼顯微鏡4（物鏡）×10（目鏡）倍，在普通光照下，切片呈現(xiàn)出亮黃色，導管分明，年輪界限清晰（圖5-a）。使用UV-2A熒光照射，切片呈現(xiàn)出帶熒光的綠色，年輪界限可見（圖5-b）。切片的導管和年輪界限清晰，早材和晚材的導管大小具有比較性，年輪易識別。吖啶橙染色的莖材切片在普通光與熒光下均呈現(xiàn)出較好的識別效果，但前者容易受到切片厚度的影響而不能識別全部年輪。將吖啶橙茶樹莖材切片4×10倍的普通光圖片和熒光圖片用Photoshop圖像處理軟件拼接后，從髓心至樹皮部分的年輪清晰可見（圖5-c、圖5-d），可以判定該茶樹樹齡為26年。

2.4 莖材切片拼接圖的比較與分析

通過茶樹莖材切片染色方法可以鑒定出貴州省六盤水市茶樹的樹齡，使用其他地區(qū)的茶樹樣本進行驗證。對其他地區(qū)的樣本切片后進行未染色、番紅染色和吖啶橙染色處理，在生物數(shù)碼顯微鏡下分別用普通光和熒光進行觀察和拍照。使用Photoshop圖像處理軟件對茶樹4個方向的年輪圖片進行拼接，拼接圖片包括茶樹髓心至樹皮的全部年輪。考慮到每個方向年輪圖片的相似性，故文中每個樣本只展示了1個方向的年輪圖片（圖6）。

所有茶樹樣本中，吖啶橙染色的莖材切片，在普通光下，100~1?000?μm識別范圍中，年輪邊界清晰（圖7）；在熒光下，500~1?000?μm識別范圍中，黃色的年輪邊界清晰；200?μm識別范圍中，大小導管在年輪邊界處過渡，木射線可見；100?μm識別范圍中，導管、薄壁細胞、木纖維、木射線明晰，年輪邊界的木纖維呈現(xiàn)黃色（圖8）。結果表明，吖啶橙染色法是茶樹年輪鑒定的一種可行方法。

將打磨過的茶樹樣本與吖啶橙染色后的茶樹莖材切片進行年輪點數(shù)，人眼識別打磨過的茶樹橫截面（圖9-a），熒光顯微鏡下識別吖啶橙染色茶樹莖材切片（圖9-b）。每個茶樹樣本的4個方向均采用了以上兩種方法確定樹齡。顯微鏡識別年輪與人眼識別年輪存在差異（表2），人眼識別的年輪數(shù)目均比顯微鏡識別的年輪個數(shù)少，存在1.5~3.5年的誤差。故在本試驗材料中，使用吖啶橙染色技術點數(shù)莖材切片年輪的方法可以提高樹齡鑒定的精確度。

注：a：普通光照下4×10倍吖啶橙染色茶樹莖材切片；b：熒光下4×10倍吖啶橙染色茶樹莖材切片；c：普通光下4×10倍吖啶橙染色茶樹莖材切片拼接圖；d：熒光下4×10倍吖啶橙染色茶樹莖材切片拼接圖

注：A：普通光顯微鏡下未染色茶樹莖材切片拼接圖；B：熒光顯微鏡下未染色茶樹莖材切片拼接圖；C：普通光顯微鏡下番紅染色茶樹莖材切片拼接圖；D：熒光顯微鏡下番紅染色茶樹莖材切片拼接圖；E：普通光顯微鏡下吖啶橙染色茶樹莖材切片拼接圖；F：熒光顯微鏡下吖啶橙染色茶樹莖材切片拼接圖。a：西藏林芝；b：云南西雙版納；c：云南昆明；d：湖北黃岡；e：四川成都；f：廣西南寧

圖7 普通光顯微鏡下不同識別范圍的吖啶橙染色茶樹莖材切片

圖8 熒光顯微鏡下不同識別范圍的吖啶橙染色茶樹莖材切片

注：a：人眼識別打磨過的茶樹莖材橫截面；b：顯微鏡識別吖啶橙染色的茶樹莖材切片

表2 茶樹樣本的年輪信息

注：A：人眼識別茶樹莖材橫截面的年輪數(shù)；B：顯微鏡識別吖啶橙莖材切片的年輪數(shù)。1：西藏林芝；2：云南西雙版納；3：云南昆明；4：貴州六盤水；5：湖北黃岡；6：四川成都；7：廣西南寧

Note: A: Identification of annual rings of cross section of tea stem by human eyes. B: Identification of annual rings in stem section of Acridine Orange by microscope. 1: Tibet Linzhi. 2: Yunnan Sipsongpanna. 3: Yunnan Kunming. 4: Guizhou Liupanshui. 5: Hubei Huanggang. 6: Sichuan Chengdu. 7: Guangxi Nanning

3 討論

陳濤林等[23]在柳州古茶樹樹齡研究中，對茶樹采用生長錐法取芯后浸泡在FeCl3溶液中，處理后的樹芯年輪邊界呈現(xiàn)藍色，然后通過人眼識別年輪，鑒定樹齡。但茶樹年輪細密且不清晰，鑒定樹齡的準確性仍需提高。與其相比，本試驗采用吖啶橙染色后通過熒光顯微鏡識別年輪的方法對7棵直徑范圍為3.00~7.23?cm的茶樹進行分析，鑒定出樹齡為10~29年，1?cm樹芯年輪數(shù)為6~10年，在識別效率和精確度上均有所提高。基于保護茶樹的原則，本試驗所有試材均為已死亡的茶樹，未采集活體茶樹試材。該方法在一定程度上對活體大茶樹、古茶樹的樹齡鑒定同樣具有參考意義，可采用生長錐取得樹芯進行適當染色后在熒光顯微鏡下確定樹齡。

熒光顯微鏡技術是利用特定波長照射被測物質，在顯微鏡下加以檢視的方法[24-25]。吖啶橙染色后的茶樹莖材切片在熒光照射下，莖材切片被激發(fā)出熒光，可清晰識別年輪特征。吖啶橙是經(jīng)典的靈敏熒光染料，染色后需立即觀察，否則會因熒光逐漸減弱而影響識別效果。本試驗中使用吖啶橙染色方法處理過的茶樹莖材切片，在數(shù)字圖像系統(tǒng)中呈現(xiàn)出最好的識別狀態(tài)。該方法對茶樹木材進行解剖、切片、染色的技術簡便，使用的儀器常見，經(jīng)濟成本較低，可以有效地對茶樹年輪進行準確鑒定，可用于各地區(qū)茶樹樹齡確定，進而對茶樹的歷史、環(huán)境、生態(tài)、氣候等諸多方面提供依據(jù)。

茶樹不僅具有較高的經(jīng)濟價值，還有用重要的文化價值和科研價值[26]。目前人們對古茶樹樹齡的爭議較大，應當根據(jù)科學數(shù)據(jù)客觀判定樹齡。大茶樹或古茶樹的價值不在于它的樹齡，而在于它資源的稀有性和重要性[27]，科學地鑒定茶樹樹齡工作對于大茶樹和古茶樹的保護、宣傳和利用都具有重要意義。

致謝：衷心感謝揚州大學博士生導師王莉教授的專業(yè)建議和指導，感謝中國農業(yè)科學院茶葉研究所陳亮研究員的專業(yè)指導，感謝西南林業(yè)大學木材標本館博士生導師邱堅教授的試驗指導和碩士研究生王云龍在試驗上給予的幫助。

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A Preliminary Study on Determining Tea Plant Age Based on Anatomical Structure of Tea’s Stem

JIANG Yan1, LI Xinghui2, PU Dian3, LAN Zengquan4*, WU Tian1*

1. Southwest Landscape Architecture Engineering Research Center of State Forestry Administration, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Tea Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. School of Ecology and Soil and Water Conservation, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 4. Tea Ecology Research Center, Southwest Green Development Institute, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China

Tea plants were taken as the research objects in this study. Using tea stem slicing and dyeing technologies, the age of tea plants was accurately determined based on the digital images. Under ordinary light and fluorescence of bio-digital microscope, the untreated sections of tea stem, saffron-dyed sections and acridine orange-dyed sections of tea stem were compared and analyzed. The result shows that acridine orange dyeing was the best to determine the age of tea plants. The acridine orange dyeing method combined with digital image analysis had the characteristics of fast, accurate, simple and low cost. In conclusion, the technology also had a scientific reference significance for the identification of annual rings of living large and ancient tea plants.

stem slices of tea plant, dyeing technology, fluorescence, growth ring, digital image

S571.1

A

1000-369X(2020)04-492-09

2019-09-19

2019-10-30

國家現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-19）、國家自然科學基金（31470690）、古茶樹保護與可持續(xù)利用國家創(chuàng)新聯(lián)盟([2018]96）、云南省教育廳財政廳項目（LY2017-002）

江燕，女，碩士研究生，研究方向植物資源與應用。

lzq@swfu.edu.cn；wutianpotato@swfu.edu.cn

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