歐二綾，趙懿琛，陽(yáng) 騰，趙德剛,2

(1.貴州大學(xué) 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院，茶學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)家農(nóng)業(yè)部植物新品種DUS測(cè)試貴陽(yáng)分中心，貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴陽(yáng) 550006)

棉花(Gossypiumspp)屬于錦葵科棉屬植物，是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。棉屬植物能產(chǎn)生一種特有的植保素—棉酚(Gossypol)，棉酚是棉花所特有的一種多酚羥基聯(lián)萘醛類(lèi)次生代謝物，經(jīng)由甲羥戊酸途徑(MVA)在細(xì)胞質(zhì)中合成[2]，在法尼基二磷酸合成酶(FPS)的催化作用下經(jīng)異戊烯基焦磷酸(IPP)生成法尼基二磷酸，再經(jīng)杜松烯合酶(CADS)、轉(zhuǎn)錄因子(GaWRKY1)以及杜松烯-8-羥化酶(GaCYP706B1)等幾種關(guān)鍵酶的催化作用下代謝合成棉酚[3]。棉酚的生物合成有多種酶和轉(zhuǎn)錄因子的參與。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)棉酚在抗生育、抗氧化、抗癌、抗病毒和抗菌等方面具有卓越的功效[4-8]。因此對(duì)于棉酚的功能、作用以及活性研究也在逐漸增加[9-13]。

已有研究通過(guò)測(cè)定種子萌發(fā)后的子葉、根系和離體根系無(wú)性系的棉酚動(dòng)態(tài)變化，得知棉酚含量在根系中逐漸增加并積累，證明棉花根系是棉酚主要合成部位，并由根系向地上部分輸送，儲(chǔ)存至地上部分的色素腺體中[14-15]。

為了進(jìn)一步明確棉酚是否只在根系合成，棉酚的合成機(jī)制，以及與色素腺體的關(guān)系。本研究利用組培技術(shù)獲得無(wú)菌種子苗、無(wú)根幼苗和有根幼苗以及生根數(shù)不同的幼苗，對(duì)它們的色素腺體密度、棉酚含量以及棉酚生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行分析。以期闡述棉花根系與色素腺體密度和棉酚含量之間的關(guān)系，為發(fā)掘更多棉酚生物合成關(guān)鍵基因和腺體合成相關(guān)基因，通過(guò)構(gòu)建干涉載體或CRISPR/cas9系統(tǒng)編輯創(chuàng)制植株有酚，種子低酚的棉花新種質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的‘中S9612’(Gossypouimhirsutum)種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所惠贈(zèng)，該材料屬有腺體高酚陸地棉品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同生根狀態(tài)幼苗培育 陸地棉‘中S9612’棉籽經(jīng)濃硫酸脫絨后，清水漂洗干凈，種子浸泡4～5 h至種殼變軟，于超凈臺(tái)中剝?nèi)シN殼。種仁使用0.1%的升汞溶液消毒10 min后，無(wú)菌水清洗4～5次，無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，接種于1/2 MS培養(yǎng)基(1/2 MS+30.0 g·L-1蔗糖+8.0 g·L-1瓊脂)上。獲得無(wú)菌苗后，根據(jù)1/2MS培養(yǎng)基和吲哚丁酸(IBA)促生根的特性，將生長(zhǎng)至2～3片真葉的無(wú)菌苗，切取子葉以上 5～7 cm帶真葉幼苗，分別放置于添加不同質(zhì)量濃度(0、0.05、0.1、0.5和1.0 mg·L-1)IBA的1/2 MS培養(yǎng)基(1/2 MS+30.0 g·L-1蔗糖+ 8.0 g·L-1瓊脂+不同質(zhì)量濃度IBA)中，培養(yǎng)基pH均為5.8～6.0，121 ℃滅菌20 min。于 28～32 ℃，光照為2 000 lx的植物培養(yǎng)室培養(yǎng)。切口部位開(kāi)始膨大并產(chǎn)生少量白色愈傷組織，5 d后開(kāi)始產(chǎn)生不定根，20 d后獲得5種生根狀態(tài)不同的高酚棉幼苗材料，統(tǒng)計(jì)各處理組的生根情況用于后續(xù)試驗(yàn)。其中生根率=生根數(shù)/接種株數(shù)×100%，平均不定根數(shù)=不定根數(shù)/接種株數(shù)。

1.2.2 無(wú)根幼苗、有根幼苗與無(wú)菌種子苗培育 按“1.2.1”方法培育‘中S9612’種子萌發(fā)，待無(wú)菌苗生長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)，將部分材料切取子葉以上5～7 cm帶真葉幼苗置于未添加任何激素的MS培養(yǎng)基(4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂)中，培養(yǎng)基pH為 5.8～6.0，處理材料部分傷口愈合，產(chǎn)生白色愈傷組織，部分生根，取有根幼苗和無(wú)根幼苗新長(zhǎng)出莖段和葉片與無(wú)菌種子苗的莖段和葉片進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 莖葉腺體密度觀(guān)察 將獲得的無(wú)根幼苗、有根幼苗以及不同生根狀態(tài)幼苗各取4片大小較為一致的葉片(從上往下數(shù)第2片真葉)，平鋪于體式顯微鏡下觀(guān)察腺體，每片葉片取5個(gè)視野的平均值作為葉片腺體密度的值，取樣部位分別為蜜腺右、蜜腺左、中脈中、左脈中、右脈中[16]；莖段取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的各4段，將莖段剖開(kāi)，去除內(nèi)部組織留取表皮，平鋪于體式顯微鏡下觀(guān)察腺體，每個(gè)莖段隨機(jī)選取5個(gè)視野的平均值作為莖段腺體密度值；采用Excel 2007、Oringin 8.5統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 棉酚含量測(cè)定 采用超高效液相色譜法(UPLC)測(cè)定棉酚含量[17]。稱(chēng)取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g±0.1 mg溶于乙腈-0.2%磷酸水溶液中，配制成濃度分別為0.1、0.5、1、5、20、50 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，0.22 μm的水性濾膜過(guò)濾，-20 ℃避光保存。棉花樣品經(jīng)45 ℃低溫烘干至恒量，研磨破碎后過(guò)60目篩，稱(chēng)取0.1 g±0.1 mg溶于乙腈-0.2%磷酸水溶液，超聲震蕩提取15 min后， 1 000 g離心5 min，上清經(jīng)0.22 μm的水性濾膜過(guò)濾，-20 ℃避光保存。

UPLC購(gòu)自Thermo Fisher Scientific有限公司，色譜柱Hypersil GOLDTM C18柱(100 mm× 2.1 mm，1.9 μm)；乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5 棉酚合成關(guān)鍵基因表達(dá)量測(cè)定 棉酚合成關(guān)鍵基因引物序列根據(jù)NCBI公布的棉花杜松烯合酶基因(CDN1，GenBank登錄號(hào)： U88318.1)、WRKY轉(zhuǎn)錄因子(WRKY1，GenBank登錄號(hào)：KF031069.1)、細(xì)胞色素P450單加氧酶基因(CYP706B1，GenBank登錄號(hào)：AF332974.1)的CDS序列設(shè)計(jì)3對(duì)對(duì)應(yīng)的熒光定量PCR引物，內(nèi)參為棉花管家基因EF-1ɑ(表1)。引物合成委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，且將引物溶解稀釋成10 μmol·L-1的使用濃度。

總RNA的提取按照試劑盒RNAiso Plus(Takara，大連)提供的方法進(jìn)行，微量核酸測(cè)定儀(Nanophotometer,廣州)對(duì)RNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，再經(jīng)12 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；cDNA反轉(zhuǎn)錄合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Takara，大連)提供的方法進(jìn)行。再以cDNA為模板，使用EF-1ɑ基因引物(表1)進(jìn)行內(nèi)參PCR擴(kuò)增，檢測(cè)cDNA質(zhì)量能否用于后續(xù)試驗(yàn)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將可用cDNA 10倍稀釋作為模板，以?xún)?nèi)參基因EF-1α為參照，用3對(duì)熒光定量PCR引物(表1)，參照SYBR Premix Ex TaqTM(Takara，大連)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行Real time-PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。每個(gè)樣品做3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理及分析采用ΔCT法。目的基因相對(duì)含 量=2-平均ΔCT, ΔCT=CT(樣本/對(duì)照)-CT內(nèi)參。

表1 引物及序列Table 1 Primers

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生根狀態(tài)幼苗色素腺體密度和棉酚含量

2.1.1 幼苗色素腺體密度 利用不同質(zhì)量濃度IBA誘導(dǎo)獲得一系列不同生根狀態(tài)的幼苗(表2和圖1)。從表2和圖1可看出，隨著IBA質(zhì)量濃度的升高，幼苗生根率增加，平均不定根數(shù)也增多。隨后進(jìn)一步分析根系對(duì)色素腺體密度的影響，結(jié)果如圖2所示，不定根多的幼苗莖葉腺體密度顯著高于不定根少的。莖的腺體密度在平均不定根數(shù)1.7和2.3之間產(chǎn)生顯著差異，葉的腺體密度在平均不定根數(shù)為2.4和3.1時(shí)逐漸趨于平穩(wěn)。不同生根狀態(tài)幼苗莖、葉的腺體密度總體趨勢(shì)是：一定范圍內(nèi)，平均不定根數(shù)增多，莖、葉中色素腺體密度變大，隨著不定根增加，無(wú)菌苗莖、葉的腺體密度逐漸趨于平穩(wěn)，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)腺體密度和不定根的多少不相關(guān)。

2.1.2 幼苗棉酚含量 從圖3中可看出，平均不定根數(shù)為1.1和1.7的幼苗棉酚含量分別為 1.55 mg·g-1、1.65 mg·g-1，平均不定根數(shù)為2.3、2.4、3.1的幼苗棉酚含量分別為2.47 mg·g-1、2.00 mg·g-1、2.12 mg·g-1。幼苗棉酚含量在平均不定根數(shù)1.7和2.3之間產(chǎn)生顯著差異，且平均不定根數(shù)為2.3的幼苗棉酚含量顯著高于1.7的幼苗。一定范圍內(nèi)，隨著誘導(dǎo)生根IBA質(zhì)量濃度的升高，幼苗不定根根量增多，棉酚含量也增加，隨后趨于平穩(wěn)。結(jié)果表明棉酚含量隨一定范圍內(nèi)生根數(shù)的增加而增加，但棉酚含量與生根數(shù)不成線(xiàn)性正相關(guān)。這與上述色素腺體密度的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明根系對(duì)色素腺體密度和棉酚含量的影響可能是同步的。

表2 不同生根狀態(tài)幼苗Table 2 Seedlings with different rooting states

A.0 mg·L-1 IBA；B.0.05 mg·L-1 IBA；C.0.1 mg·L-1 IBA；D.0.5 mg·L-1 IBA；E.1 mg·L-1 IBA

不同的小寫(xiě)字母表示P<0.05，下同

圖3 不同生根狀態(tài)幼苗的棉酚含量Fig.3 Content of gossypol in seedlings with different rooting states

2.2 無(wú)根幼苗與有根幼苗色素腺體密度和棉酚含量

為了明確根系是否為棉酚的唯一合成部位，以及根系是否對(duì)腺體有影響，對(duì)無(wú)根幼苗和有根幼苗的莖段和葉片進(jìn)行腺體密度觀(guān)察統(tǒng)計(jì)。在相同的放大倍數(shù)下，莖段中的色素腺體呈不規(guī)則分布，體積較大(圖4-A和圖4-B)；而葉片中的色素腺體分布較均勻，體積較小(圖4-C和圖4-D)。幼苗在無(wú)根狀態(tài)下(圖5)，莖葉色素腺體密度顯著低于有根幼苗。同時(shí)，無(wú)根幼苗莖葉棉酚含量顯著低于有根幼苗，根系中的棉酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他部位。

A.無(wú)根幼苗莖色素腺體；B.有根幼苗莖色素腺體；C.無(wú)根幼苗葉色素腺體；D.有根幼苗葉色素腺體

圖5 無(wú)根幼苗與有根幼苗腺體密度和棉酚含量變化Fig.5 Changes in density of pigment glands and content of gossypol of rootless seedlings and rooted seedlings

2.3 不同生根狀態(tài)幼苗全株棉酚合成關(guān)鍵基因表達(dá)量

棉酚含量除了與根系和腺體密度相關(guān)外，棉酚生物合成關(guān)鍵基因也是重要的影響因素之一。因此，測(cè)定不同生根狀態(tài)幼苗中棉酚生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)量，并對(duì)其進(jìn)行分析。如圖6所示，GhCDN1和GhWRKY1基因表達(dá)量隨平均不定根數(shù)的增加而增加，說(shuō)明GhCDN1和GhWRKY1表達(dá)趨勢(shì)與棉酚含量變化趨勢(shì)基本一致。對(duì)棉酚具有反饋調(diào)節(jié)作用的GhCYP706B1基因表達(dá)量隨平均不定根數(shù)的增加而降低，GhCYP706B1表達(dá)模式與棉酚含量變化趨勢(shì)相反。

2.4 種子無(wú)菌苗不同組織棉酚合成關(guān)鍵基因表達(dá)量

為了解根系為何是棉酚主要合成部位，對(duì)未處理的種子無(wú)菌苗各組織棉酚生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖7所示，未處理種子無(wú)菌苗中，GhCDN1、GhWRKY1和GhCYP706B1表達(dá)量均在根中最高，葉次之，莖最低，且根的表達(dá)量與莖葉均差異顯著。

圖6 不同生根狀態(tài)幼苗棉酚合成關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression level of key genes for gossypol biosynthesis in seedlings with different rooting states

2.5 無(wú)根幼苗和有根幼苗不同組織棉酚合成關(guān)鍵基因表達(dá)量

明確根系為棉酚主要合成部位后，為了解其他部位是否也合成棉酚，比較無(wú)根幼苗與有根幼苗不同組織的棉酚合成關(guān)鍵基因表達(dá)量。從圖8可看出，無(wú)根幼苗地上部分GhCDN1、GhWRKY1和GhCYP706B1表達(dá)量均高于有根幼苗。有根幼苗根系棉酚含量顯著高于莖葉，與種子無(wú)菌苗根系棉酚含量最高實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。推測(cè)地上部分可能存在棉酚的生物合成，合成棉酚含量較根系弱，不能引起棉酚含量發(fā)生顯著變化。

3 討 論

棉酚的生物合成受羥甲基戊二酰CoA還原酶[18]、法尼基二磷酸合成酶[19]、杜松烯合酶[20-21]、杜松萜烯-8-羥化酶[22]、脫氧半棉酚-6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶[23]、轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY[24]、細(xì)胞色素P450還原酶和單加氧酶[25-26]、Dirigent蛋白[27]等酶和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Tian等[28]研究發(fā)現(xiàn)，棉酚的積累通常伴隨著杜松烯合酶CDN基因和細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP706B1基因的激活，GhWRKY1主要是結(jié)合杜松烯合酶并調(diào)控其活性參與棉酚合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子[29]，此3種基因在棉酚的積累過(guò)程中相當(dāng)活躍。故以GhCDN1、GhWRKY1和GhCYP706B1作為棉酚生物合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行分析。本研究結(jié)果表明，棉酚合成與根系之間有著密切的關(guān)系，在不同生根狀態(tài)幼苗中，測(cè)定全株幼苗的棉酚含量，平均不定根數(shù)多的幼苗棉酚含量高于平均不定根數(shù)少的，GhCDN1和GhWRKY1的表達(dá)量在平均不定根數(shù)多的幼苗中升高，GhCYP706B1的表達(dá)量反而降低，分析原因可能與倍半萜烯烴對(duì)(+)-δ-杜松烯-8-羥化酶CYP706B1的活性具有抑制作用有關(guān)[26]，導(dǎo)致GhCYP706B1表達(dá)量降低。有根幼苗莖葉的棉酚含量高于無(wú)根幼苗，測(cè)定幼苗各組織關(guān)鍵基因表達(dá)量也發(fā)現(xiàn)，3個(gè)關(guān)鍵基因均在根系中表達(dá)最高，證明棉花的根系確實(shí)是棉酚主要合成部位，這與祝水金等[14]和Smith[15]的研究結(jié)果一致。

圖7 種子無(wú)菌苗不同組織棉酚合成關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression level of key genes for gossypol biosynthesis in different tissues of sterile seedlings

圖8 有根幼苗與無(wú)根幼苗棉酚合成關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression level of key genes for gossypol biosynthesis in rooted and rootless seedlings

Ma等[30]認(rèn)為，腺體的發(fā)育途徑與棉酚合成途徑是相互獨(dú)立的，但控制腺體發(fā)育形成相關(guān)基因又能與參加次生代謝物合成的TPSs、WRKY、CDN1基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生互作，影響棉酚含量。在種子無(wú)菌苗中，除根系外，GhCDN1、GhWRKY1和GhCYP706B1在葉中的表達(dá)量最高，棉酚含量也高于莖，可能與腺體有關(guān)，莖的腺體體積較大，分布不規(guī)則，葉的腺體體積較小，分布較均勻，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明葉的腺體密度遠(yuǎn)高于莖，而腺體又能對(duì)棉酚含量產(chǎn)生影響，故葉的棉酚含量高于莖。在無(wú)根幼苗中，莖葉的基因表達(dá)量較有根幼苗高，棉酚含量卻低于有根幼苗，由于根系是棉酚的主要合成部位，缺失根系的幼苗合成棉酚能力下降，存在于地上部分的腺體與棉酚合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生互作導(dǎo)致基因表達(dá)量升高，只是沒(méi)能引起棉酚含量發(fā)生顯著變化，這與祝水金等[14]認(rèn)為控制色素腺體的基因可能同時(shí)影響棉酚合成能力的猜測(cè)相符合。腺體是儲(chǔ)存棉酚的場(chǎng)所[15]，在不同生根狀態(tài)幼苗中，當(dāng)平均不定根數(shù)為2.4、3.1時(shí)，對(duì)應(yīng)的棉酚含量較平均不定根數(shù)為2.3的棉酚含量有所下降，而莖葉的腺體密度并沒(méi)有相應(yīng)的降低，表現(xiàn)為腺體密度和棉酚含量不成顯著正相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果一致[30]。

考慮到激素對(duì)基因表達(dá)的影響，比較添加 0 mg·L-1IBA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)幼苗與無(wú)根幼苗的基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)添加0 mg·L-1IBA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的幼苗地上部分3個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量顯著低于無(wú)根幼苗，但棉酚含量顯著高于無(wú)根幼苗，腺體密度無(wú)顯著差異，更加證明根系對(duì)棉酚含量起決定性作用，棉酚合成關(guān)鍵基因表達(dá)量的高低不僅與棉酚含量相關(guān)，腺體也是其中一個(gè)影響因素。本研究明確根系、棉酚和腺體三者之間的關(guān)系，證實(shí)利用激素誘導(dǎo)生根的方式用于證明根系、棉酚與腺體之間的關(guān)系是可行的。后期可利用有腺體低酚棉與無(wú)腺體低酚棉進(jìn)行類(lèi)似研究，進(jìn)一步探究腺體與棉酚的關(guān)系。