王娟菲，李海源，秦 君，商文靜，胡小平

(農業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，西北農林科技大學 植物保護學院,陜西楊凌 712100)

棉花黃萎病是典型的土傳性真菌病害，病原菌從棉花根部入侵，越過皮層到達維管束后，隨水分的輸送向上傳播[1]，繼而引起葉片的黃化萎蔫和脫落，嚴重時導致植株死亡。1966年Schnathorst從抗病性顯著下降的抗黃萎病棉株中分離出兩株黃萎病致病菌系，按其對3個鑒別品種 ‘海島棉’‘岱字棉’和‘愛字棉’上的反應型劃分為兩個類型：非落葉型SS-4菌系和落葉型T9菌系，T9菌系的毒力比SS-4的強10倍[2]。與非落葉型菌株相比，落葉型菌株具有引致棉花發(fā)病重、發(fā)病快、損失嚴重等特點[3-7]。

ABA(Absicisic acid)是調節(jié)植物生長發(fā)育以及非生物和生物脅迫反應的關鍵植物激素[8]。在植物響應外界環(huán)境壓力、調節(jié)氣孔開放、調控葉片脫落、種子萌發(fā)與休眠等非生物脅迫中起重要的調節(jié)作用[9-12]。同時，ABA也在病原菌侵染和寄主免疫過程發(fā)揮作用，當ABA含量增加兩倍，番茄灰霉病的發(fā)病率可降低50%[13]。在稻瘟菌與ABA互作中，ABA在免疫反應中起負向調控作用，與SA信號通路相拮抗參與植物免疫過程[14]。研究表明，病原菌可以通過內源產生低水平ABA參與調控植物的免疫反應，如薔薇色尾孢霉菌Cercosporarosicola，菜豆尾孢霉菌Cercosporacruenta和灰葡萄孢霉菌Botrytiscinerea[15-16]。bcaba1是灰葡萄孢霉菌上第一個被發(fā)現的ABA合成相關基因[17]，后續(xù)研究發(fā)現bcaba2、bcaba3和bcaba4基因也參與灰葡萄孢霉菌ABA的合成[18]。目前，多數研究主要集中在干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫下ABA的產生以及對植物生理生長等的影響[12，19-22]。但尚未見到關于ABA與大麗輪枝菌落葉型菌株引起棉花落葉關系的研究報道。

本文通過NCBI比對灰葡萄孢霉菌ABA合成相關基因，得到落葉型大麗輪枝菌XJ592中ABA合成相關基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4，對4個基因進行克隆和敲除，比較分析其產孢量、菌落形態(tài)、壓力響應、致病性、落葉情況等，了解這些基因對大麗輪枝菌的生物學特性及致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

野生型大麗輪枝菌XJ592菌株(落葉型菌株)和根癌農桿菌菌株EHA105由西北農林科技大學土傳病害實驗室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自康為世紀公司。敲除質粒pOSCAR和帶有潮霉素篩選標記的質粒pA-Hyg-OSCAR均由Fungal Genetics Stock Center(www.fgsc.net)提供。

1.2 ABA合成基因生物信息學分析

在NCBI(National Centre of BiotechnologyInformation)網站搜索灰葡萄孢霉菌ABA合成基因bcaba1、bcaba2、bcaba3和bcaba4的蛋白質序列信息，使用Blastp程序進行大麗輪枝菌中同源蛋白的搜索和比對分析。

1.3 敲除載體構建及敲除突變體的獲得

參照Pazet的報道，設計同源臂擴增引物用于擴增目的基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4的側翼序列，構建基因敲除載體[23]。通過PCR和酶切驗證后，將陽性敲除載體導入農桿菌菌株EHA105感受態(tài)細胞中，進行農桿菌介導的遺傳轉化。根據轉化子能擴增出潮霉素抗性基因Hyg但不能擴增出目的基因的原則，得到候選敲除轉化子。將具有潮霉素B(50 μg/mL)抗性的轉化子進行單孢純化。采用PCR檢測篩選陽性轉化子，用于后續(xù)試驗。

1.4 產孢量測定

配制濃度為1×106個/mL的敲除突變體菌株孢子懸浮液。吸取100 μL孢子懸浮液，接種至裝有50 mL Czapek液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于25 ℃、120 r/min條件下黑暗搖培7 d后，在顯微鏡下用血球計數板測量孢子懸浮液濃度，以野生型XJ592菌株為對照，重復3次。

1.5 壓力敏感性測定

在PDA上培養(yǎng)7 d的野生型、敲除突變體菌落邊緣打直徑為5 mm的菌餅,分別接種到CM培養(yǎng)基、含有0.03% H2O2(氧化壓力)、0.01% SDS(細胞壁壓力)、1.2 mol/L山梨醇(滲透壓力)、0.7 mol/L NaCl(鹽脅迫)、0.2 g/L剛果紅(細胞壁脅迫)的CM平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d后觀察菌落特征，用“十字”交叉法測量菌落直徑。每個處理接種3個培養(yǎng)皿，重復3次。

1.6 致病力測定

接種方法參照棉花孢子懸浮液浸根接種法[24]。待棉花幼苗長到2片真葉平展時，將棉苗小心取出，用清水清洗干凈，浸在孢子濃度為106個/mL的懸浮液中30 min，以無菌水作為空白對照。接種21 d后，統(tǒng)計發(fā)病率，計算病情指數。接菌后30 d統(tǒng)計棉花的落葉數量和落葉率。病情指數=[∑(各級病株數×相應病級)/(調查總株數×4)]×100[25]。

1.7 數據分析的方法

產孢量采用SAS v8.01軟件的TTEST過程進行t測驗(P=0.05)分析，野生型菌株和敲除突變體菌株的菌落直徑、壓力篩選及病情指數等的方差分析采用ANOVA過程進行。

2 結果與分析

2.1 ABA合成基因的生物信息學分析

基于灰葡萄孢霉菌的ABA合成相關基因bcaba1(AJ609392)、bcaba2(AJ851088)、bcaba3(AM237449)和bcaba4(AM237450)[11]蛋白序列，與大麗輪枝菌基因組序列經Blastp比對共得到4個同源基因，分別命名為Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)、Vdaba4(表1)。

表1 基因基本信息Table 1 Basic information of genes

2.2 敲除載體構建及突變體篩選

用CTAB法提取大麗輪枝菌XJ592基因組DNA，使用Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4基因的上下游引物分別擴增其側翼序列，采用OSCAR一步法構建基因敲除載體[15]，轉化大腸桿菌，用潮霉素抗性基因檢測引物Hyg-F和Hyg-R檢測陽性菌落并送擎科生物公司測序，將測序正確的菌落接種于LB培養(yǎng)基搖培，提取質粒。采用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將敲除質粒轉入野生型菌株XJ592中，經過50 mg/L潮霉素抗性篩選，并使用潮霉素基因檢測引物、目的基因檢測引物對敲除轉化子菌株進行PCR驗證，共得到8個突變體菌株(圖1)。選取△Vdaba1-20、△Vdaba1-21、△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba2(2)-20、△Vdaba2(2)-11、△Vdaba4-12、△Vdaba4-11等8個代表性突變體進行下一步研究。

A：潮霉素引物PCR電泳圖。M：DL2000Maker；泳道1：pA-Hyg-OSCAR質粒；泳道2：野生型XJ592；泳道3-10：敲除突變體 △Vdaba1-20、 △Vdaba1-21、 △Vdaba2(1)-48、 △Vdaba2(1)-36、 △Vdaba2(2)-20、 △Vdaba2(2)-11、 △Vdaba4-12、 △Vdaba4-11；泳道11：陰性對照。B、C、D、E：目的基因檢測結果電泳圖。M：DL2000Maker；B圖，泳道1-2：敲除突變體 △Vdaba1-20、 △Vdaba1-21；泳道3：野生型XJ592；C圖，泳道1-2：敲除突變體 △Vdaba2(1)-36、 △Vdaba2(1)-48；泳道3：野生型XJ592；D圖，泳道1-2：敲除突變體 △Vdaba2(2)-11、 △Vdaba2(2)-20；泳道3：野生型XJ592；E圖， 泳道1-2：敲除突變體 △Vdaba4-12、 △Vdaba4-11；泳道3：野生型XJ592。

2.3 產孢量測定

將野生型菌株和突變體菌株接種于液體查氏培養(yǎng)基中，120 r/min室溫搖培，7d后測孢子濃度。結果表明，突變體△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba2(2)-20、△Vdaba2(2)-11、△Vdaba4-12和△Vdaba4-11產孢量與野生型的無顯著性差異，而突變體△Vdaba1-20和△Vdaba1-21產孢量顯著少于野生型的(圖2)，說明Vdaba1參與大麗輪枝菌孢子的形成，Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4對大麗輪枝菌的產孢過程沒有顯著作用。

2.4 菌落形態(tài)觀察及壓力篩選

將野生型XJ592和4個基因共8個突變體接種于CM培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d，運用十字交叉法測量菌落直徑，結果發(fā)現，突變體△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba2(2)-20和△Vdaba2(2)-11菌落直徑顯著小于野生型的，突變體△Vdaba4-12、△Vdaba4-11、△Vdaba1-20和△Vdaba1-21菌落直徑與野生型無顯著差異。在含有20 μg/mL SDS培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)15 d后，突變體△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba4-12、和△Vdaba4-11菌落直徑顯著高于野生型XJ592的(圖3)。在 0.03% H2O2壓力脅迫下，突變體△Vdaba4-12和△Vdaba4-11菌落直徑顯著受到抑制，△Vdaba1-20、△Vdaba1-21、△Vdaba2(1)-48和△Vdaba2(1)-36突變體菌落直徑顯著增大?？梢奦daba4基因的存在可以使大麗輪枝菌更能適應氧化環(huán)境。在1.2 mol/L山梨醇壓力下，所有突變體菌落直徑均顯著大于野生型的，說明ABA合成相關基因可負向調節(jié)大麗輪枝菌對滲透壓的敏感性。在含有0.7 mol/L NaCl的培養(yǎng)基上，只有△Vdaba2(2)突變體與野生型直徑無顯著差異，其余突變體菌落直徑均顯著大于野生型的，說明Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba4的存在使大麗輪枝菌對鹽脅迫更敏感。在0.2 g/L剛果紅壓力脅迫中，只有△Vdaba2(1)菌落直徑顯著減小。

“*”表示P=0.05下具有顯著性差異 “*”Significant difference at P=0.05

*表示經單因素方差分析P=0.05水平具有顯著性 *Significant difference at P=0.05

2.5 致病力測定

野生型XJ592和基因突變體菌株接種‘冀棉11’，21 d后，接種野生型和突變體的棉花植株都表現出典型的黃萎病癥狀(圖4)。按照棉花黃萎病苗期病害調查分級標準統(tǒng)計發(fā)病情況，突變體△Vdaba1-20、△Vdaba1-21、△Vdaba4-12和△Vdaba4-11菌株接菌棉花植株的病情指數低于野生型菌株的，而突變體△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba2(2)-20和△Vdaba2(2)-11的病情指數與野生型無顯著差異(圖5)。接種30 d后，所有突變體都可以引起整株棉花葉片全部脫落，與野生型XJ592菌株接菌植株無差異(數據略)。

圖4 野生型及突變體菌株接種棉花21 d后發(fā)病情況Fig.4 Disease symptoms of cotton at 21 days post inoculation of XJ592 and mutants

“*”表示經單因素方差分析P=0.05具有顯著性差異 “*”Significant difference at P=0.05

3 討 論

通過對大麗輪枝菌侵染寄主引發(fā)寄主落葉或葉片萎蔫而不脫落的表型可將大麗輪枝菌分為落葉型和非落葉型[2]，落葉性狀是大麗輪枝菌種群演化的重要類型。在中國，隨著陸家云首次報道落葉型大麗輪枝菌之后，在全國主產棉區(qū)也陸續(xù)開展了落葉型大麗輪枝菌的相關研究。吳獻忠等[26]對來自山東的16株大麗輪枝菌的致病力研究將其分為強致病力(與落葉型相似)、中等致病力和弱致病力，并發(fā)現山東省有落葉型菌系存在。落葉型大麗輪枝菌因其發(fā)病快、致病力強近年來逐漸成為棉花黃萎病的優(yōu)勢種群[27-30]。自從其被發(fā)現以來，科研工作者一直致力于探討落葉型大麗輪枝菌引起寄主落葉的分子機理。通過隨機多態(tài)性擴增(RAPD)確定落葉型菌株有一段長為 0.55 kb的特異序列，這為分子標記在黃萎病流行病學方面提供了新思路[31]。同時，對大麗輪枝菌致病基因挖掘與功能鑒定?；蚪M功能分析等方面開展相關研究，進一步推動了大麗輪枝菌病源學、流行病學、病原與寄主互作機制研究的發(fā)展[32-34]。Zhang等[35]通過比較基因組學鑒定出高致病力的落葉型菌株有一段LSR(lineage-specific regions)區(qū)編碼的7個VdDfs基因，該區(qū)域在低致病非落葉型菌株基因組中基本完全缺失。通過對這7個基因結構域分析表明 VdDfs基因簇為一個典型的次生代謝物合成基因簇，該基因簇產生的次級代謝物N-酰基乙醇胺(NAEs)[36]。研究表明(NAEs)可以與ABA相互作用發(fā)揮生物學功能[37]。植物落葉是一個自然而復雜的生理過程，涉及生理、生化和分子網絡等多個調控系統(tǒng)[38-41]。有研究表明，在水壓力脅迫和一些不良環(huán)境脅迫下，ABA的產生會顯著上調，從而可以調節(jié)葉片脫落[42-43]。一直以來認為一些低等病原物不能合成ABA，直到最近研究發(fā)現病原菌侵染后植物葉片ABA水平會上升，主要原因是病原菌自身合成ABA的水平提高所致。雖然病原菌只合成少量的ABA，但可以觸發(fā)植物對外界環(huán)境的生理反應[44]。當灰葡萄孢霉菌侵染番茄后，番茄葉片的ABA是未接菌處理的10倍多。研究者將ABA的合成分為4步：侵染時寄主誘導病原菌ABA合成，接著病原菌釋放ABA或者ABA前體物，此時植物體內的ABA產量逐漸積累，同時病原菌自身有抑制ABA代謝。相比只接菌，ABA和病原菌孢子共同處理后番茄葉片會更快的出現壞死現象[45]。因此植物的抗病程度與ABA合成相關。在擬南芥中，ABA合成相關基因aba2-1突變體對鐮刀菌的抗性顯著增強[46]。而aba-1突變體對疫霉菌和丁香假單胞菌的抗性明顯減弱，植物葉片枯黃，脫落[47]。然而目前有關ABA合成與落葉型大麗輪枝菌引起棉花落葉之間關系的研究尚未見報道。本研究中，大麗輪枝菌ABA合成相關基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4不影響大麗輪枝菌XJ592引起的棉花落葉，但影響大麗輪枝菌的產孢能力、菌落生長及致病力等，說明ABA合成相關基因在病原菌引起的落葉過程中并不發(fā)揮功能，而對大麗輪枝菌的生理生長與致病過程起到至關重要的作用。可能ABA在生物因素引起的落葉過程和非生物脅迫引起的落葉過程中發(fā)揮不同的生物功能。

大麗輪枝菌ABA合成基因Vdaba1的敲除對大麗輪枝菌的產孢量有顯著的抑制作用，說明Vdaba1參與大麗輪枝菌的產孢過程，Vdaba1敲除突變體菌株的病情指數下降，可能是由于孢子產量減少導致的。本研究△Vdaba4突變體接菌棉花后，致病力減弱，說明Vdaba4也參與大麗輪枝菌致病過程。同時發(fā)現△Vdaba4突變體菌株對H2O2壓力更敏感，說明Vdaba4基因在大麗輪枝菌抵抗氧化壓力中起促進作用。這可能是△Vdaba4突變體導致大麗輪枝菌致病性減弱的原因之一?；騐daba2(1)和Vdaba2(2)對大麗輪枝菌的致病性沒有影響，卻對大麗輪枝菌的營養(yǎng)生長起正向調控作用。因此大麗輪枝菌ABA合成基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4在調節(jié)大麗輪枝菌的生長和致病性方面行使不同的功能。前人研究表明，病原菌侵染植物寄主時，可以產生許多次級代謝物，而且真菌通常是以基因簇的形式參與次級代謝物的形成[48]。病原菌ABA的產出通過遠距離的運輸與轉移，參與病原菌致病侵染過程[12]。

ABA在響應各種不良環(huán)境中發(fā)揮重要作用，如在各種非生物脅迫干旱、水等不適條件中，ABA的產生可以幫助植物度過不良環(huán)境[38-39]。但在大麗輪枝菌引起的棉花落葉方面，ABA合成相關基因敲除沒有發(fā)揮決定作用。一方面本研究中通過NCBI比對灰葡萄孢霉菌ABA合成相關基因，并不是落葉型大麗輪枝菌ABA合成所特有的基因，不同真菌ABA合成過程可能存在差異。另一方面在這個研究中只做了單基因敲除，大麗輪枝菌ABA合成過程可能存在基因冗余的情況，致使突變體接菌棉花也表現出落葉表型，需要進一步開展雙敲除、三敲除甚至四敲除突變體研究，測試他們對棉花落葉性狀的影響。