熊 豐，李春喜，席杏媛，周?chē)?guó)英,

(1.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所/中國(guó)科學(xué)院 藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；2.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所/中國(guó)科學(xué)院 高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001；3.青海省青藏高原特色生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

大黃是應(yīng)用廣泛的重要中藥材之一，也是中醫(yī)常用藥物，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《傷寒雜病論》及《本草綱目》中已有記載。大黃為多年生草本，藥用部分為干燥根和根莖[1]。有解毒，清熱瀉火，通經(jīng)逐瘀，涼血止血等多種功效，是“將軍”之藥，一直以來(lái)具有巨大的市場(chǎng)需求。唐古特大黃(Rh.tanguticumMaxim.ex Balf)，隸屬于石竹目(Caryophyllales)，蓼科(Polygonaceae)，大黃屬(RheumL.)，主要分布于青海、西藏、四川、甘肅海拔1600～4400m的高海拔地區(qū)[2-5]，是大黃的主要生藥來(lái)源之一。而唐古特大黃及相關(guān)藥物生產(chǎn)一直依賴野生資源，大量采挖致使野生大黃日益減少，天然資源近于枯竭[6-8]。因此對(duì)唐古特大黃資源的保護(hù)顯得尤為重要[9-10]。青海省唐古特大黃以其療效著稱，受到歷來(lái)醫(yī)家的青睞，稱“西寧大黃”，為青海省重要的道地藥材。其良好的藥效品質(zhì)與青海省較高的海拔和特殊的氣候條件形成的優(yōu)良種質(zhì)可能有一定的關(guān)系[11-12]。

長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)唐古特大黃的化學(xué)成分和藥理作用研究較多[13-18]。盡管大黃的人工栽培歷史可以追溯到20世紀(jì)60年代[19]，近年來(lái)，青海省人工栽培唐古特大黃的田間管理也有了較為深入的研究[5, 20-21]。但優(yōu)質(zhì)唐古特大黃的適宜種植海拔及品系(品種)選育的工作還需要更多關(guān)注，如甘肅省栽培掌葉大黃由于缺乏良種選育而存在種質(zhì)退化[22]。為了探討唐古特大黃在青海地區(qū)的適宜的移栽種植海拔區(qū)，同時(shí)選育出優(yōu)良的唐古特大黃品系(品種)，于2017年7月大黃盛花期野外考察并確定綜合性狀表現(xiàn)較好的單株，2017年10月-2018年5月溫室育苗，2018年6月移栽到海拔2016～3763m不同生態(tài)區(qū)，考察唐古特大黃當(dāng)年的生長(zhǎng)性狀表現(xiàn)，為選育品種和推廣種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在青海省樂(lè)都縣、民和縣、大通縣、互助縣和果洛州瑪沁縣5地開(kāi)展，分別編號(hào)為A1、A2、A3、A4和A5，樣地海拔分別為2 016 m、 2 180 m、2 409 m、2 971 m和3 763 m，其中 A1～A3為灌淤型沙土，A4～A5為高寒草甸土，隨海拔升高，五處試驗(yàn)地的年均氣溫呈顯著的下降趨勢(shì)。移栽前土壤背景列于表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料 2017年7月大黃盛花期，分別在果洛州瑪沁縣大武鎮(zhèn)野生樣地和互助縣東溝鄉(xiāng)納卡村人工種植4 a田中各選50株編號(hào)掛標(biāo)簽，測(cè)株高、莖中部粗、最大葉片長(zhǎng)、寬、最大葉片葉裂數(shù)、葉裂深、基生脈數(shù)、葉柄長(zhǎng)、基部葉片數(shù)、莖生葉片數(shù)、花色、花序分枝數(shù)，7月底單株收集種子，晾干，測(cè)單株種子質(zhì)量、種子數(shù)、千粒質(zhì)量； 9-10月人工挖出地下根莖洗凈，測(cè)根莖長(zhǎng)、主根莖粗、根莖數(shù)、根莖總鮮質(zhì)量；并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，各選出10株(共20株)，用種子進(jìn)行株系溫室育苗。

1.2.2 育 苗 2017-10-10在海東生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)智能溫室進(jìn)行株系育苗，用無(wú)紡布育苗袋，袋高30 cm，直徑10 cm，用森林土裝袋27 cm，放入種子3粒，苗高10 cm，4～5葉間苗，保留1株，育苗數(shù)滿足田間移栽試驗(yàn)需求。2018年4月底測(cè)苗高、葉片數(shù)、根莖長(zhǎng)、根中部粗、根分枝數(shù)，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，各選出5株系(共10株系),移栽田間試驗(yàn)。野外采集時(shí)10株系性狀表現(xiàn)見(jiàn)表2，其中果洛株系為L(zhǎng)1～L5，互助株系為L(zhǎng)6～L10。

1.2.3 試驗(yàn)布置 在5個(gè)不同海拔試驗(yàn)地，從2018年5月8日-6月6日依次移栽，試驗(yàn)小區(qū)面積5 m×4 m=20 m2，每平方米移栽4株，每小區(qū)80株，每公頃4.00萬(wàn)株，隨機(jī)排列，重復(fù)3次。移栽前整地，挖穴，穴深30 cm，直徑25～30 cm，將無(wú)紡布袋底部剪去，整袋放入挖好的穴中，埋土1/3，底肥按照磷酸二銨225 kg/hm2和尿素225 kg/hm2混合，每穴施入11.25 g，再埋土與地 面平。

1.3 指標(biāo)觀測(cè)

2018年9月取樣測(cè)數(shù)據(jù)。小區(qū)兩邊第2行為樣段區(qū)，數(shù)據(jù)均在樣段區(qū)內(nèi)取得。

1.3.1 植株田間評(píng)價(jià) 各試驗(yàn)點(diǎn)移栽15 d后，整個(gè)小區(qū)內(nèi)觀測(cè)成活數(shù)，計(jì)算移栽成活率，并進(jìn)行補(bǔ)栽，2018年8月統(tǒng)計(jì)補(bǔ)栽后成活率，觀測(cè)植株株型及田間整齊度。

1.3.2 植株地上性狀 9月采樣觀測(cè)，在樣段內(nèi)連續(xù)測(cè)10株，統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)，用鋼卷尺測(cè)株高、最大葉片的葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)、葉裂長(zhǎng)和葉裂寬，計(jì)算葉裂占比。

1.3.3 植株地下性狀 測(cè)完地上數(shù)據(jù)后，挖出對(duì)應(yīng)地下根，沖洗干凈，用鋼卷尺測(cè)根長(zhǎng)，用游標(biāo)卡尺測(cè)最大根直徑，現(xiàn)場(chǎng)在DT-502電子天平上稱根莖鮮質(zhì)量，記錄側(cè)根數(shù)。

1.3.4 鮮質(zhì)量產(chǎn)量 用根莖鮮質(zhì)量×每公頃有效株數(shù)為每公頃根莖鮮質(zhì)量產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS V20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性和多重比較，利用R軟件(R version 3.5.1)結(jié)合“Nisus-Liu/GRA”包進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，采用OriginPro 2018進(jìn)行作圖?；疑P(guān)聯(lián)度分析采用不同株系的平均株高、葉片數(shù)、最大葉的葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)、葉裂長(zhǎng)、葉裂寬、葉裂占比以及側(cè)根數(shù)、根長(zhǎng)、根直徑、根鮮質(zhì)量和產(chǎn)量，共計(jì)13個(gè)性狀參數(shù)組成數(shù)據(jù)集合，以各性狀的最優(yōu)值為參考序列，以各株系平均值為對(duì)比序列，計(jì)算各株系與參考序列的灰色關(guān)聯(lián)度，并進(jìn)行排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔株系間田間評(píng)價(jià)

不同海拔樣點(diǎn)，移栽成活率和補(bǔ)栽成活率均顯著不同(P<0.01)，A4樣點(diǎn)移栽和補(bǔ)栽成活率均為最高，分別為87.32%和97.33%，其次為A5樣點(diǎn)，分別為85.89%和93.79%。A1樣點(diǎn)移栽成活率高于A2、A3樣點(diǎn)，達(dá)83.50%，但由于補(bǔ)栽后發(fā)生根腐病，其補(bǔ)栽成活率低于A2與A3樣點(diǎn)，僅為80.83%。

各試驗(yàn)點(diǎn)不同株系間移栽后成活率差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)(表3)，株系間移栽成活率從高到低依次為L(zhǎng)8>L9>L7>L6>L10>L1>L2>L3>L5>L4，移栽后株系與試驗(yàn)點(diǎn)間互作成活率F=2.52>F0.01=1.79，差異極顯著(P<0.01)；補(bǔ)栽成活率株系間差異不顯著，僅A1樣點(diǎn)因部分株系出現(xiàn)根腐病導(dǎo)致株系間差異顯著(P<0.01)，補(bǔ)栽后株系與試驗(yàn)點(diǎn)間互作成活率F=1.14

不同株系間株型和田間整齊度也有顯著差異(表3)，A1、A2和A3樣點(diǎn)的株型L1、L2、L3、L5、L6、L7號(hào)株系表現(xiàn)為直立，L4、L8、L9、L10號(hào)表現(xiàn)為半直立，A4和A5樣點(diǎn)所有株系均表現(xiàn)為半直立。田間整齊度除L4外，其他均表現(xiàn)為整齊或較整齊。

2.2 不同海拔間植株性狀差異

植株各項(xiàng)性狀表現(xiàn)均隨海拔增大而呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)(P<0.01)。唐古特大黃所有性狀在A1樣點(diǎn)(樂(lè)都)均表現(xiàn)最佳(圖1)，平均株高 61.30 cm，葉片數(shù)9.46葉，側(cè)根數(shù)4.67條(圖1-A)，最大葉的葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)、葉裂長(zhǎng)、葉裂寬及葉裂占比分別為58.92 cm，51.44 cm，37.05 cm，18.29 cm，7.79 cm和92.30%(圖1-B和1-C)，平均根長(zhǎng)、根直徑、根鮮質(zhì)量分別為32.01 cm，4.81 cm和444.10 g(圖1-D)，根據(jù)單位面積有效植株數(shù)計(jì)算出A1樣點(diǎn)鮮質(zhì)量產(chǎn)量為 14 473.78 kg/hm2。與之相反，A5樣點(diǎn)(果洛)表現(xiàn)最差，平均株高僅11.84 cm，葉片數(shù)平均為 4.06片，側(cè)根數(shù)2.37條，其最大葉的葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根直徑分別為15.85 cm、13.82 cm、 6.21 cm、14.92 cm和1.51 cm，且A5樣點(diǎn)葉片沒(méi)有發(fā)生葉裂，同時(shí)，相比A1樣點(diǎn)，A5樣點(diǎn)的根鮮質(zhì)量和產(chǎn)量分別降低了425.34 g和 13 766.81 kg/hm2。A4樣點(diǎn)(互助)僅側(cè)根數(shù)與A5沒(méi)有顯著差異，其他性狀均顯著(P<0.01)優(yōu)于A5樣點(diǎn)。同時(shí)，A4樣點(diǎn)除根長(zhǎng)與A3樣點(diǎn)沒(méi)有顯著差異外，其他性狀均顯著(P<0.01)低于A3樣點(diǎn)。

而A2樣點(diǎn)(民和)可能由于移栽前1個(gè)月使用了“玉米思”除草劑(玉米田專用)，對(duì)大黃地上部分的生長(zhǎng)造成影響，株高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)以及葉裂長(zhǎng)、葉裂寬的表現(xiàn)反而低于A3樣點(diǎn)(大通),A2與A3點(diǎn)的株高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)葉裂長(zhǎng)和葉裂寬分別為39.75 cm與57.68 cm，36.00 cm與45.71 cm，31.21 cm與37.63 cm，27.40 cm與31.71 cm，11.07 cm與14.00 cm和4.47 cm與7.11 cm；A2樣點(diǎn)葉片數(shù)(7.03)略低與A3樣點(diǎn)(7.48)，但差異不顯著，同樣，植株的側(cè)根數(shù)(3.80與3.81)和葉裂占比(73.00%與68.01%)在A2與A3樣點(diǎn)間差異不顯著；而地下性狀如根長(zhǎng)、根直徑、根鮮重和產(chǎn)量均服從隨海拔升高而降低的趨勢(shì)，在A2和A3樣點(diǎn)間差異顯著，其值分別為30.19 cm與25.22 cm，3.96 cm與3.42 cm，270.69 g與176.22 g和10 013.56 kg/hm2與6 509.60 kg/hm2。

2.3 株系間植株性狀的灰色關(guān)聯(lián)分析

將10個(gè)株系的13個(gè)性狀指標(biāo)組成一個(gè)灰色系統(tǒng)，10個(gè)株系分別為L(zhǎng)1～L10，13個(gè)性狀指標(biāo)分別為C1～C13，同時(shí)以所有株系中各性狀的最優(yōu)值構(gòu)成一個(gè)理想株系L0，L0和L1～L10的各項(xiàng)指標(biāo)均列于表4中?；诨疑到y(tǒng)中數(shù)據(jù)應(yīng)為無(wú)量綱化數(shù)據(jù)，采用min-max歸一化方法(正向指標(biāo))對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理，即x′= (x-min)/(max-min),歸一化后，L0各項(xiàng)指標(biāo)均為1。利用R包“GRA”中的函數(shù)GRA，求出各比較株系與參考株系的灰色關(guān)聯(lián)程度及其排序(表5)，關(guān)聯(lián)程度越高的株系即越接近理想株系，為本次試驗(yàn)的較優(yōu)株系。本試驗(yàn)中株系排序依次為L(zhǎng)2、L9、L1、L10、L5、L3、L6、L8、L4、L7。采用最短距離法對(duì)10個(gè)株系進(jìn)行系統(tǒng)層次聚類，得到結(jié)果如圖2所示。根據(jù)聚類結(jié)果，L2、L9、L1、L10和L5可以聚為一類，說(shuō)明這5個(gè)株系表現(xiàn)較優(yōu)，具有進(jìn)一步研究的潛力，L3、L6、L8其次，可以作為備擇選項(xiàng)。

圖中相同圖案柱狀圖或點(diǎn)線圖上標(biāo)注的不同字母表示同一性狀在不同海拔之間有顯著差異(P<0.05)。

表4 各株系13個(gè)性狀平均表現(xiàn)及參考株系性狀均值Table 4 Average values of 13 traits in 10 lines and values of 13 traits in reference line

表5 各株系灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)及排序結(jié)果Table 5 Grey relational coefficient and ranking of 10 lines

3 結(jié)論與討論

青海省的自然條件和農(nóng)業(yè)自然資源具有過(guò)渡性特點(diǎn)并表現(xiàn)出明顯的垂直地域差異等多種類型的生態(tài)區(qū)域，地形地貌和氣候等自然條件的垂直變化十分明顯。本研究結(jié)果表明海拔高度對(duì)唐古特大黃育苗移栽后成活率、生長(zhǎng)性狀、產(chǎn)量等指標(biāo)影響極大。海拔對(duì)于唐古特大黃移栽苗的生長(zhǎng)和成活率表現(xiàn)出二元化的影響。

圖2 灰色關(guān)聯(lián)分析株系間聚類結(jié)果Fig.2 Cluster results of grey relational analysis in 10 lines

一方面，低海拔移栽樣地帶給唐古特大黃移栽苗的生長(zhǎng)益處是顯而易見(jiàn)的。海拔低，氣溫高，生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)量大，反之生長(zhǎng)速度慢，生長(zhǎng)量小[23]。海拔2 016 m～2 409 m地區(qū)年均氣溫 4.7～7.8 ℃，生長(zhǎng)量高，如唐古特大黃藥用部分根莖性狀，單株根鮮質(zhì)量176.22～444.10 g，根鮮質(zhì)量產(chǎn)量6 509.60～ 14 473.78 kg/hm2，海拔 2 971～3 763 m以上地區(qū)年均氣溫2.0～0.6 ℃，生長(zhǎng)量低，單株根鮮質(zhì)量?jī)H18.76～91.04 g，根鮮質(zhì)量產(chǎn)量?jī)H706.97 ～3 556.60 kg/hm2，最低海拔根鮮重和產(chǎn)量相比最高海拔分別增加了22.67倍和19.47倍。同時(shí)，在A4、A5兩個(gè)樣點(diǎn)，所有株系株型均表現(xiàn)為半直立狀態(tài)，而低海拔的A1、A2、A3樣點(diǎn)，則多數(shù)株系表現(xiàn)為直立株型，這也與低海拔樣點(diǎn)較高氣溫帶來(lái)的快速生長(zhǎng)相關(guān)。

另一方面，海拔對(duì)移栽苗的成活率呈現(xiàn)出不同的影響模式。該試驗(yàn)中移栽種苗在A4和A5樣點(diǎn)成活率最高，即在其種源地具有較好的成活率，這說(shuō)明其對(duì)于種源生境的適應(yīng)較好。這與針對(duì)竹子的相關(guān)研究結(jié)果類似[24]，而其余3處海拔較低樣點(diǎn)移栽成活率在海拔最低的A1樣點(diǎn)成活率最高，可能與低海拔地區(qū)較為溫暖的氣候條件相關(guān)，但同時(shí)此氣候條件可能也會(huì)導(dǎo)致病害發(fā)生概率的增加，如A1樣點(diǎn)在補(bǔ)栽后發(fā)生根腐病。對(duì)于種源生境為較高海拔地區(qū)的唐古特大黃而言，由于長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境，其具有較優(yōu)秀的抗寒抗凍能力，但高海拔地區(qū)病害發(fā)生率較低，可能導(dǎo)致唐古特大黃缺乏相應(yīng)的抗病機(jī)制。因而在后期新品種的大規(guī)模推廣中，應(yīng)注意病蟲(chóng)害的防治及避免暖濕生境。

有研究表明，高海拔大黃中幾種有效成分的含量都顯著高于低海拔大黃[25]，意味著高海拔栽培大黃可能具有更優(yōu)品質(zhì)。但同時(shí)，也有研究表明栽培唐古特大黃的品質(zhì)與種植年限顯著相關(guān)[5, 26]。因此，考慮到產(chǎn)量、質(zhì)量及總收益，適宜的唐古特大黃栽培海拔范圍還需要對(duì)多年數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

灰色關(guān)聯(lián)分析是用于分析多因素系統(tǒng)的重要方法，因而在選種育種的工作中被廣泛應(yīng)用[27]。本研究中，綜合分析了唐古特大黃的13個(gè)性狀，需要同時(shí)評(píng)價(jià)10個(gè)株系表現(xiàn)，因此選用灰色關(guān)聯(lián)分析可以很好的反映不同株系間的綜合差異。通過(guò)設(shè)置理想的參考株系L0，計(jì)算其他株系與參考株系的關(guān)聯(lián)程度，可以得到與參考株系最為相近的株系，即表現(xiàn)最優(yōu)的株系。從本年度植株性狀表現(xiàn)的結(jié)果綜合分析，L1、L2、L5、L9和L10號(hào)株系表現(xiàn)優(yōu)良，其中L1、L2、L5均為果洛株系，說(shuō)明原產(chǎn)地為果洛的株系可能具有更優(yōu)的遺傳背景。

本研究為選育真正的唐古特大黃優(yōu)良品種積累了經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)，運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)分析方法，為唐古特大黃新品種的選育提供了可靠思路，同時(shí)，研究樣地涉及海拔2 016～3 763 m，共5個(gè)梯度，這也為未來(lái)新品種的推廣范圍提供了理論依據(jù)。本試驗(yàn)為移栽后第1年結(jié)果，更長(zhǎng)時(shí)間的試驗(yàn)觀測(cè)仍需要進(jìn)一步開(kāi)展。