孫權(quán) 劉士臣 徐偉明 孟德欣

(佳木斯大學 1基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007；2附屬第一醫(yī)院；3濰坊市坊子區(qū)仁康醫(yī)院)

糖尿病(DM)是以高血糖為特征的慢性代謝紊亂綜合征〔1～3〕。DM心肌病(DCM)由Hamby等〔4〕于1974年首次提出，是DM患者本身出現(xiàn)的特殊心肌病變，主要有心肌能量代謝或結(jié)構(gòu)異常改變，導致心肌細胞重塑，最終引起心臟收縮和舒張功能障礙〔5〕。褪黑素(MT)由松果體分泌，對人類的睡眠、生殖及晝夜節(jié)律等起到調(diào)節(jié)作用，對機體的神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)均有影響。研究發(fā)現(xiàn)，MT是一種很強的抗氧化劑，可有效清除氧自由基〔6〕，提高機體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低過氧化脂質(zhì)(LPO)的水平，降低血清中丙二醛(MDA)含量〔7，8〕，也可以誘導抗氧化防御酶和抑制細胞凋亡，從而發(fā)揮抗氧化效應(yīng)，對多種疾病具有防治效用。本文擬分析MT對DM大鼠心肌MDA、達氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量、糖基化終末產(chǎn)物(AGE)及其受體(RAGE)表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 清潔級雄性Wistar大鼠80只(長春億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司購買)，體重180～200 g，佳木斯大學動物實驗中心分籠飼養(yǎng)，每天光照12 h，自由攝食和飲水。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；MT(浙江延年褪黑素公司)。

1.2動物分組、模型建立、給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為正常組、模型組、低劑量MT組和高劑量MT組各20只，分籠飼養(yǎng)。模型組、低劑量MT組和高劑量MT組給予高脂高糖飲食4 w。大鼠禁食12 h，腹腔注射1%STZ 50 mg/kg體重，正常組按照同等劑量注射檸檬酸緩沖液。給藥后72 h尾靜脈采血，空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。實驗時每4 w檢測血糖一次。造模后每天10∶00～14∶00灌胃給藥一次，低劑量MT組劑量為10 mg/kg體重，高劑量MT組為20 mg/kg體重，正常組和模型組同等劑量生理鹽水灌胃。持續(xù)給藥16 w。

1.3血糖值測定 給藥前，給藥后和實驗中分別檢測大鼠空腹血糖。測量前禁食、水12 h，尾靜脈采血，血糖儀測量血糖值。

1.4標本采集 斷髓法處死實驗大鼠，剪開大鼠胸骨，打開胸腔，暴露心臟。沿著心底大血管的根部剪斷大鼠心臟，剖開右心耳，由左心室進針用200 ml左右生理鹽水沖洗，當右心耳流出無色液體時可以停止沖洗，再用4%多聚甲醛溶液進行心臟固定，游離心臟放入10%中性甲醛溶液內(nèi)浸泡。而后將組織制成5 μm厚石蠟切片。

1.5HE染色 ①脫蠟至水;②蘇木素染色6 min，蒸餾水沖洗5 min;③1%鹽酸-乙醇分化30 s，再次蒸餾水沖洗5 min;④伊紅染色3 min，蒸餾水沖洗5 min;⑤脫水透明;⑥中性樹膠封片;⑦顯微鏡下組織學觀察并拍照。

1.6超敏二步法免疫組化染色 ①烤片30 min;②脫蠟脫水后將切片放入盛有TBS緩沖液的抗原熱修復(fù)盒中，微波爐中加熱至煮沸，20 min后取出，自然冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，各5 min;③5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，37℃，20 min;④一抗(RAGE濃度為1∶50，AGE濃度為1∶100)，4℃過夜;⑤復(fù)溫至室溫，PBS洗3次，各5 min;⑥試劑Ⅰ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min。試劑Ⅱ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min;⑦二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察，隨時中斷，蒸餾水洗3次，各3 min;⑧蘇木素染色片刻，1%HCl-酒精分化30 s，蒸餾水洗3次，各5 min，自來水沖洗2 h(AGE染色時，省略此步);⑨片子脫水透明;⑩中性樹膠進行封片;圖像采集分析采用BI200軟件，IOD值越小，陽性表達越高。

1.7比色法測定MDA、CAT和GSH-Px含量 制備10%心肌組織勻漿后測定蛋白含量，用試劑盒測定。

1.8統(tǒng)計學處理 使用SPSS19.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1精神狀態(tài) 正常組精神狀態(tài)佳，每日攝取食物量比較穩(wěn)定，體重增加量隨周齡的增加而增加，動作反應(yīng)敏捷，皮毛光滑有光澤，眼睛發(fā)亮有神，鼠尾色澤淡紅，大、小便正常。模型組精神狀態(tài)萎靡，每日攝取食物量增多、過頻，體重增加隨周齡增加緩慢有的甚至不增加，動作反應(yīng)有些遲鈍，皮毛灰暗而無光澤，眼睛暗淡無神，鼠尾顏色淡白，大便時干時稀，小便過頻。低劑量MT組和高劑量MT組精神狀態(tài)欠佳，每日攝取食物量趨于正常，體重增加遲緩，隨周齡增長略有增加，動作反應(yīng)略有緩慢，皮毛比較柔順略有光澤，眼睛發(fā)灰，略顯呆滯，鼠尾毛色略有光澤，大便略稀，小便趨于正常。

2.2血糖測定 MT處理16 w后，與正常組〔(5.77±0.73)mmol/L〕比較，模型組、低劑量MT組和高劑量MT組血糖〔(22.73±3.05)、(20.94±0.74)、(21.17±2.97)mmol/L〕明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量MT組和高劑量MT組血糖值雖略降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3MDA、CAT和GSH-Px含量比較 MT處理16 w后，與模型組比較，低劑量MT組和高劑量MT組MDA含量明顯降低，CAT、GSH-Px含量明顯增高(P<0.05)；而與正常組比較，低劑量MT組和高劑量MT組MDA、CAT、GSH-Px含量無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組心肌組織中MDA、CAT和GSH-Px含量測定

2.4心肌HE染色結(jié)果 正常組心肌細胞體積正常，排列整齊，心肌各層均勻，結(jié)構(gòu)清晰；胞質(zhì)清澈，胞質(zhì)顏色正常；心肌細胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻。模型組心肌細胞體積明顯增大，排列紊亂、腫脹，心肌各層次不均，結(jié)構(gòu)不清；胞質(zhì)渾濁，顏色變淺；細胞核呈長桿狀，核固縮，核膜皺縮，出現(xiàn)雙核，排列紊亂，染色質(zhì)邊聚于核膜下呈顆粒狀。低劑量MT組和高劑量MT組心肌細胞體積略小，排列趨于整齊，心肌各層次結(jié)構(gòu)和心肌細胞間隙略清晰可以辨認；胞質(zhì)略有渾濁，顏色略淺，細胞核形態(tài)趨于正常的圓形或橢圓形，染色質(zhì)均勻可見。低劑量MT組較高劑量MT組更明顯一些(圖1)。

圖1 各組心肌HE染色(×400)

2.5心肌AGE和RAGE表達含量變化 AGE棕黃色陽性表達見于心肌細胞胞質(zhì)或心肌間質(zhì)內(nèi)。RAGE棕黃色陽性表達多見于心肌細胞膜。模型組AGE、RAGE棕黃色斑塊較正常組明顯增多且顏色深染，而低劑量組和高劑量MT組細胞中棕黃色斑塊減少，顏色變淺。MT處理16 w后，與模型組比較，低劑量MT組和高劑量MT組AGE、RAGE蛋白表達IOD值明顯增多(P<0.05)；而與正常組比較低，劑量MT組和高劑量MT組AGE、RAGE蛋白表達無明顯差異(P>0.05)(表2和圖2)。

表2 各組心肌組織中AGE和RAGE蛋白表達

圖2 各組心肌中AGE、RAGE蛋白免疫組化(×400)

3 討 論

生理狀態(tài)下，人和哺乳動物血清中MT的含量隨著晝夜交替，呈節(jié)律性的波動，其分泌量表現(xiàn)為，夜間比白天要高出5～10倍，正常情況下，凌晨2∶00～3∶00達到分泌量最高值。研究表明，MT對DM大鼠血糖的影響有兩種觀點：MT可以通過改善胰島素抵抗程度〔9〕和調(diào)控胰島β細胞胰島素的分泌釋放〔10，11〕，影響機體胰島素的代謝，并能促進細胞對葡萄糖的利用，從而影響機體的血糖代謝，直接降低DM大鼠血清中的血糖水平；報道〔12〕顯示MT對血糖水平?jīng)]有影響，可能由于實驗過程中給藥時間、給藥方式和給藥劑量不同等所致。

氧化應(yīng)激是指打破機體內(nèi)氧化與抗氧化作用的動態(tài)平衡，機體趨向于被氧化狀態(tài)，導致體內(nèi)中性粒細胞炎性過度浸潤，蛋白酶的分泌量過度增加，產(chǎn)生大量氧化代謝的中間產(chǎn)物——活性氧簇(ROS)。ROS是導致人體衰老及各種疾病發(fā)生的一個重要因素，已被普遍人們所認可。ROS在體內(nèi)以游離的自由基存在，主要為超氧陰離子、H2O2和羥自由基(OH)等為主。體內(nèi)ROS的大量存在通過多種途徑導致細胞凋亡，造成組織損害。ROS既是促發(fā)和加速線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(MPT)開放的重要效應(yīng)分子，又是MPT開放的產(chǎn)物。這種正反饋機制使MPT開放具有自我放大效應(yīng)和“全”或“無”的特點，使線粒體膜電位的下降進入不可逆過程，細胞發(fā)生凋亡，造成細胞損害。機體內(nèi)除有氧化系統(tǒng)，也有抗氧化系統(tǒng)，抗氧化系統(tǒng)有兩大類：一類是酶類抗氧化系統(tǒng)，包括CAT、GSH-Px、SOD等；另一類是非酶類抗氧化系統(tǒng)，有維生素E、GSH、維生素C等，還有一些微量元素硒、鋅和銅等。這兩類抗氧化系統(tǒng)主要是通過直接或間接地方法降低ROS在體內(nèi)的含量，如CAT主要催化分解體內(nèi)的H2O2，降低其在體內(nèi)的含量，避免造成細胞組織的損傷。維生素C可以有效地清除自由基，通過逐級供給電子而轉(zhuǎn)變?yōu)榘朊撗蹩箟难岷兔摎淇箟难岬倪^程清除體內(nèi)超氧陰離子、OH、有機自由基(R)和有機過氧基(ROO)等自由基。MDA是機體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)后發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化代謝的終產(chǎn)物，可引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子發(fā)生交聯(lián)聚合，具有細胞毒性。MDA也會影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物和線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶的活性，并且還可以加劇質(zhì)膜的損傷。在生物體內(nèi)衰老與抗衰老的生理性研究中，MDA含量是一個常用的重要的氧化指標。CAT是一種酶類自由基清除劑，為生物防御體系的關(guān)鍵酶，存在于動物的各種細胞組織內(nèi)，以肝臟中濃度最高，它的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，清除體內(nèi)過多的過氧化氫，從而使機體細胞免于遭受H2O2的毒害。CAT作用于H2O2的機制是H2O2的岐化，必須有兩個H2O2先后與CAT相遇碰撞在活化中心上，H2O2濃度越高，分解越快。CAT是過氧化物酶體系的標志酶，約占過氧化物酶體系酶總量的40%，是一種生物體內(nèi)研究抗氧化的重要指標。GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，廣泛存在機體內(nèi)，GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸。GSH-Px主要包括4種，分別為組織GSH-Px、血漿GSH-Px、磷脂氫過氧化物GSH-Px及具有胃腸道專屬性GSH-Px。在氧化應(yīng)激反應(yīng)的途徑中，GSH-Px的活力大小是機體內(nèi)抗氧化能力重要指標的體現(xiàn)。

MT是人體自體分泌的體內(nèi)天然的抗氧化劑，兼有脂溶性和水溶性，能自由通過細胞膜，能直接和(或)間接清除人體內(nèi)多種自由基，并能夠增強抗氧化酶類的活性。MT與細胞膜上受體結(jié)合后，通過第二信使如環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、磷脂酶C等使細胞內(nèi)磷酸化級聯(lián)反應(yīng)激活相關(guān)蛋白，進而調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性及相關(guān)基因的表達。大鼠切除松果體后，可使大鼠體內(nèi)的氧自由基過多堆積，ROS的活性和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強〔13〕。而Geeta等〔14〕給予患者外源性MT 1個月后，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的MT水平升高、活性增強、MDA濃度下降，證實MT可以改善T2DM患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的狀態(tài)。也有研究學者研究表明給予DCM患者外源性MT 2個月后，體內(nèi)細胞組織中MDA濃度降低，血漿和胞質(zhì)中GSH-Px濃度和活性都有所增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)水平降低，并且空腹血糖及糖化血紅蛋白水平較治療前明顯改善〔15〕。Hegab等〔16〕給予STZ誘導的DM大鼠外源性MT后，發(fā)現(xiàn)MT能使部分坐骨神經(jīng)的傳導速度得到一定的恢復(fù)，并能顯著降低血清內(nèi)MDA的濃度，這說明MT能改善DM患者的神經(jīng)病變，對抗體內(nèi)增強的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實驗結(jié)果也表明，MT可通過多條件途徑抑制DM心肌細胞中的過度氧化應(yīng)激狀態(tài)。AGE是蛋白質(zhì)的氨基酸、脂質(zhì)和脂蛋白非酶性糖基化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，在DM的微血管并發(fā)癥中，RAGE信號通路扮演著重要角色〔17〕。AGE廣泛存在于機體的血液及各種組織、細胞中，AGE作用廣泛，通過兩種途徑發(fā)揮其生物學效應(yīng)：①直接途徑，直接修飾改變蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等的空間結(jié)構(gòu)和功能，造成機體損傷；②間接途徑，AGE與特異性受體RAGE結(jié)合后，導致機體發(fā)生病理性改變，可激活多個細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，可誘導生成氧自由基及滅活一氧化氮(NO)等，參與不同類型細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)和血栓形成的過程〔18〕。高血糖狀態(tài)下，蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化后，氧自由基生成也隨之增加，并促進AGE形成，從而導致惡性循環(huán)〔17〕。AGE生成具有不可逆性，即使糾正了高血糖，AGE也不能降至正常水平，且可在組織中繼續(xù)不斷的累積。因此，AGE在DM并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展的全過程中起到重要作用。

RAGE廣泛存在于人體各類細胞中，屬于多配體受體，不僅參與內(nèi)體炎癥反應(yīng)，還與DM慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。RAGE與AGE結(jié)合后，激活相關(guān)信號反應(yīng)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜電位去極化和減少糖原合成酶激酶(GSK)-3β磷酸化，導致細胞功能障礙。DM可以引起心房重構(gòu)，擾亂心房內(nèi)傳導系統(tǒng)，是房顫的危險因素之一。AGE與RAGE的結(jié)合與DCM的發(fā)生密切相關(guān)，阻斷兩者的結(jié)合可能會成為預(yù)防和治療DCM的新靶點〔19，20〕。MT可抑制AGE和RAGE間的相互影響，從而能減輕DCM患者的心肌損傷程度，延緩病程。

致謝：黑龍江省北藥與功能食品優(yōu)勢特色學科建設(shè)項目的支持！