施愛(ài)明 錢(qián)晨月 趙奉倫 蘇存錦 潘杰

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州 215004)

胰島素的分泌受餐后血糖水平升高的刺激，也受腸促胰素效應(yīng)的調(diào)控，在健康者中，腸促胰素效應(yīng)負(fù)責(zé)大約70%的餐后胰島素分泌，對(duì)正常機(jī)體的血糖調(diào)節(jié)過(guò)程起著重要作用。然而生理性腸促胰素在分泌后1～2 min內(nèi)即被二肽基肽酶(DPP)-4降解失活，DPP-4 抑制劑通過(guò)抑制DPP-4 對(duì)活性腸促胰素的水解作用，增加活性腸促胰素的水平而改善血糖控制，是治療2型糖尿病(T2DM)的新靶點(diǎn)〔1，2〕。臨床使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，DPP-4抑制劑的療效存在個(gè)體差異，決定DPP-4抑制劑治療反應(yīng)的因素目前尚未完全闡明，個(gè)體遺傳基因差異可能是影響DPP-4抑制劑療效反應(yīng)原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者普遍存在腸促胰素效應(yīng)減弱，可能原因包括腸促胰素分泌減少、DPP-4降解腸促胰素活性升高及腸促胰素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損等；因此參與腸促胰素合成、降解和作用通路的相關(guān)基因的遺傳變異成為研究 DPP-4抑制劑療效差異的靶點(diǎn)〔3～7〕。

本研究擬對(duì)編碼胰高血糖素樣肽受體(GLPIR)基因的rs3765467位點(diǎn)和抑胃肽受體(GIPR)基因的rs10423928位點(diǎn)、腸促胰素合成通路中TCF7L2基因的rs7903146位點(diǎn)、影響DPP-4酶活性的rs4664443和rs12617656位點(diǎn)，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)建立單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的檢測(cè)方法，并驗(yàn)證其準(zhǔn)確性和可行性，為研究腸促胰素作用相關(guān)基因的SNP與DPP-4抑制劑療效的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選擇2018年1～6月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院就診的口服DPP-4抑制劑的T2DM患者35例，其中男27例，女8例，平均年齡為(55.6±14.7)歲。

1.2儀器與試劑 凝膠成像系統(tǒng)和水平電泳槽(上海Bio-Rad公司)；PCR擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物合成(上海生工生物有限公司)；血液基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)Magen公司)；PCR擴(kuò)增試劑盒(日本Takara公司)；美國(guó)ABI Veriti96 PCR儀(美國(guó)ABI生物系統(tǒng)公司)；PyroMark Q24焦磷酸測(cè)序儀和焦磷酸測(cè)序試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)。

1.3基因組 DNA的提取采用DNA提取試劑盒進(jìn)行35例T2DM患者的全血DNA提取，并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和純度鑒定，確保每份DNA濃度大于30 μg/μl，提取后DNA樣本置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計(jì) 在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)上分別下載rs3765467、rs10423928、rs7903146、rs4664443及rs12617656這5個(gè)SNP位點(diǎn)所在的基因序列，采用PyroMark Assay Design Software2.0(德國(guó)Qiagen公司)設(shè)計(jì)PCR引物和測(cè)序引物。5個(gè)SNP位點(diǎn)引物見(jiàn)表1。

表1 rs7903146，rs12617656，rs4664443，rs3765467和rs10423928引物序列

1.5PCR擴(kuò)增 PCR總反應(yīng)體積為50 μl，包括：Ex Taq HS 0.25 μl，10×Ex Taq緩沖液5 μl，dNTPmix 4 μl，上下游 PCR引物各1 μl，基因組DNA 5 μl，RNase-free water 33.75 μl。PCR條件：98℃ 15 min，98 10 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共循環(huán)35個(gè)周期，循環(huán)結(jié)束后72℃10 min。所有PCR產(chǎn)物應(yīng)用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行進(jìn)一步的分析和鑒定。

1.6焦磷酸測(cè)序分型檢測(cè) 取8連管，每管加入80 μl反應(yīng)體系，包括磁珠1 μl，結(jié)合緩沖液40 μl，PCR產(chǎn)物15 μl，高純水24 μl。1 400 r/min室溫振蕩10 min。打開(kāi)真空泵，將真空預(yù)備工具在高純水中清洗30 s，移到8連管的孔中抽吸樣品，捕獲帶有PCR 產(chǎn)物的親和素包被的磁珠。依次用70%乙醇、變性緩沖液、清洗緩沖液沖洗10 s，關(guān)閉真空開(kāi)關(guān)，將真空預(yù)備工具置入預(yù)加有0.4 μmol/L 測(cè)序引物(10 μmol/L測(cè)序引物1 μl和退火緩沖液24 μl)的焦磷酸測(cè)序(PSQ)24孔板中，輕輕晃動(dòng)，釋放親和素包被的磁珠。將PSQ 24孔板置于預(yù)熱好的板架上，80℃加熱2 min、室溫平衡2 min后，置于焦磷酸測(cè)序儀內(nèi)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)PyroMark Q24 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7Sanger測(cè)序驗(yàn)證 將這35例臨床樣本提取的DNA送蘇州金唯智生物有限公司采用 Sanger測(cè)序法檢測(cè)，進(jìn)行SNP的二輪驗(yàn)證，保證上述所建焦磷酸分型檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1PCR結(jié)果 凝膠電泳結(jié)果顯示，5個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物均在相應(yīng)位置呈單一條帶，見(jiàn)圖1，擴(kuò)增特異性好。

M：Marker,1.患者1，2.患者2圖1 2例患者5個(gè)SNP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.2焦磷酸測(cè)序與Sanger測(cè)序結(jié)果 對(duì)35例患者5個(gè)SNP位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行了焦磷酸測(cè)序，檢測(cè)信噪比高，非特異峰的比例均在 10%以內(nèi)，多態(tài)位點(diǎn)基因型可清晰判斷，檢測(cè)成功率100%。為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)采用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)上述患者的 5個(gè) SNP位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2～6，分型結(jié)果見(jiàn)表2。兩種方法的基因分型結(jié)果完全一致，35例患者5個(gè)SNP位點(diǎn)的突變比例與已報(bào)道的文獻(xiàn)結(jié)果相接近〔5，8-10〕。

A.焦磷酸反向測(cè)序；B.Sanger反向測(cè)序，下圖同圖2 rs3765467多態(tài)性典型測(cè)序

圖3 rs10423928多態(tài)性典型測(cè)序

圖4 rs7903146多態(tài)性典型測(cè)序

圖5 rs4664443多態(tài)性典型測(cè)序

圖6 rs12617656多態(tài)性典型測(cè)序

表2 35例患者SNP位點(diǎn)基因型焦磷酸測(cè)序結(jié)果〔n(%)〕

3 討 論

經(jīng)過(guò)引物設(shè)計(jì)篩選和對(duì)PCR的退火和循環(huán)等擴(kuò)增條件優(yōu)化，最終5個(gè)SNP位點(diǎn)可以在相同的條件下進(jìn)行擴(kuò)增，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物少，PCR擴(kuò)增特異性好。焦磷酸測(cè)序是一種基于DNA序列的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因多態(tài)性檢測(cè)、甲基化檢測(cè)及微生物鑒定等領(lǐng)域〔11～14〕，本文所建焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)信噪比高，非特異峰低，多態(tài)位點(diǎn)基因型可清晰判斷，檢測(cè)成功率100%。

文獻(xiàn)報(bào)道韓國(guó)人GLPIR基因rs3765467位點(diǎn)突變純合型比率僅為2.8%〔5〕，本文檢測(cè)到突變純合型比率與文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)人群突變純合型比率(15.3%)相近〔8〕。Meta分析結(jié)果顯示GIPR基因rs10423928位點(diǎn)攜A堿基突變與患者糖代謝異常相關(guān)〔6〕，本研究與NCBI中dbSNP公共數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的頻率一致。TCF7L2基因rs7903146位點(diǎn)為近期研究熱點(diǎn)，許多研究顯示rs7903146位點(diǎn)與多種疾病發(fā)生存在相關(guān)性，Meta分析結(jié)果顯示rs7903146位點(diǎn)的多態(tài)性與進(jìn)展為T(mén)2DM風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)〔15〕。本文結(jié)果未檢測(cè)到純合型突變，與李云〔9〕報(bào)道的200例福建籍漢族人群檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明此位點(diǎn)在中國(guó)人群發(fā)生突變的比例較低。DPP-4基因rs12617656位點(diǎn)野生型、雜合型和突變純合型比例與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔5〕。DPP-4基因rs4664443位點(diǎn)野生型、雜合型和突變純合型比例與邢曉敏〔10〕報(bào)道的中國(guó)人群的結(jié)果一致。