鄰苯三酚自氧化法對(duì)茶葉中茶多酚的抗氧化性能應(yīng)用研究

陳仕學(xué)，姚元勇，盧忠英，汪蘭，秦馨

（銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州銅仁554300）

茶作為當(dāng)今世界上最為普及的功能性飲料，具有各種保健功效，從而引起人們的廣泛關(guān)注。茶葉含有多種人體必須的有效成分，主要為咖啡堿、茶多酚（tea polyphones，TP）、氨基酸等，其中茶多酚約占茶葉干重15%～30%。茶多酚是茶葉中最重要的保健成分之一。茶多酚作為一種新型的天然抗氧化劑，具有消除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基、抗癌、抗氧化等功效。2015年，高媛圓等[1-3]研究證明：茶多酚對(duì)老年癡呆、糖尿病和乳腺癌具有防治和抑制作用；2019年，張勁等[4]對(duì)茶葉中的茶多酚功能進(jìn)行研究，表明茶多酚具有抗氧化、降血脂、降血糖、清除人體自由基等功能，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人的身體無(wú)毒副作用，且茶葉中的茶多酚含量是其他植物所無(wú)法相比的[5]，因此在化工、食品、醫(yī)藥、護(hù)膚品等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值[6-8]。

目前，國(guó)內(nèi)外許多研究者對(duì)茶葉中茶多酚的抗氧化作用都作了一定的文獻(xiàn)報(bào)道，認(rèn)為茶多酚之所以具有抗氧化能力，是因?yàn)椴瓒喾又械闹饕煞謨翰杷鼐哂泄涔δ艿姆恿u基[9]，如王媛等報(bào)道：茶多酚具備優(yōu)良的氫供體，因而能與體內(nèi)過(guò)量的自由基作用，形成比較穩(wěn)定的酚氧自由基，從而避免生物體遭受過(guò)量自由基造成的氧化損傷[10-11]；程德竹等[12]運(yùn)用紫外可見(jiàn)光分光光度法定量測(cè)定茶葉中茶多酚，通過(guò)加入茶多酚對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧自由基的清除作用來(lái)評(píng)價(jià)茶葉中茶多酚抗氧化能力。但是由于不同測(cè)試體系的測(cè)試方法與其條件相差比較大，將對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

為了使試驗(yàn)更加準(zhǔn)確可靠，本文首先要確定鄰苯三酚自氧化反應(yīng)條件，即鄰苯三酚在堿性環(huán)境中自氧化的測(cè)定波長(zhǎng)、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)速率。在此條件下，測(cè)定不同類(lèi)型茶葉中茶多酚對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生超氧自由基的清除能力，從而評(píng)價(jià)不同類(lèi)型茶葉抗氧化能力的強(qiáng)弱。目前，關(guān)于銅仁地區(qū)不同類(lèi)型茶葉中茶多酚的提取有相關(guān)報(bào)道[13-14]，但對(duì)其本地的茶葉中茶多酚抗氧化能力研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文梵凈山綠茶、梵凈山小醬白茶、銅仁苦丁茶、石阡苔茶（紅茶）為原料，采用鄰苯三酚自氧化體系來(lái)評(píng)價(jià)不同類(lèi)型茶葉的抗氧化能力，以期對(duì)開(kāi)展茶葉的綜合利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

梵凈山綠茶、梵凈山小醬白茶、銅仁苦丁茶、石阡苔茶（紅茶）：貴州芳瑞堂生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

鄰苯三酚：阿拉丁化學(xué)試劑網(wǎng)；磷酸鹽（phosphate beffered soiution，PBS）緩沖液：博士德生物工程有限公司；鹽酸：成都金山化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市恒興化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器

HHS數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；100 μL～1 000 μL 移液槍?zhuān)荷虾h林有限公司；MP電子分析天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；C-30玻璃儀器氣流烘干器：鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司；759S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 鄰苯三酚自氧化反應(yīng)條件確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

精密量取5mL（pH=8.0）PBS緩沖溶液與0.1 mL（0.4 mg/mL）鄰苯三酚溶液于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至10 mL。反應(yīng)5 min后，以（pH=8.0）PBS緩沖液做空白對(duì)照，進(jìn)行紫外光譜掃描，確定吸收峰波長(zhǎng)。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)速率的確定

在檢測(cè)波長(zhǎng)確定下，每隔5 min進(jìn)行1次紫外光譜掃描，共掃描50 min，然后以吸光值A(chǔ)對(duì)反應(yīng)時(shí)間作線性關(guān)系圖。挑選出線性關(guān)系最好的一段，其所經(jīng)歷的時(shí)間即為反應(yīng)時(shí)間t，其方程的斜率為鄰苯三酚自氧化速率V0，從而確定鄰苯三酚自氧化反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)速率。

2.2 茶多酚的抗氧化試驗(yàn)研究

2.2.1 不同類(lèi)型不同質(zhì)量濃度茶葉中茶多酚對(duì)超氧自由基的清除

精密量取0.1 mL（0.4 mg/mL）鄰苯三酚溶液和5 mL（pH=8.0）PBS緩沖液、分別加入不同濃度（0.04、0.06、0.08、0.12、0.14 mg/mL）的梵凈山綠茶溶液 1 mL，置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至10 mL，反應(yīng)5 min后，以（pH=8.0）PBS緩沖溶液做空白對(duì)照，在320 nm波長(zhǎng)處，每隔5 min測(cè)定1次吸光值[15]，共反應(yīng)25 min；同法分別加入不同濃度（0.06、0.08、0.1、0.14、0.16 mg/mL）梵凈山小醬白茶茶多酚溶液、不同濃度（0.1、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL）石阡苔茶紅茶茶多酚溶液、不同濃度（0.08、0.1、0.12、0.14、0.16 mg/mL）銅仁苦丁茶茶多酚溶液，從而比較不同類(lèi)型不同濃度茶多酚的超氧自由基清除作用，以吸光值A(chǔ)對(duì)反應(yīng)時(shí)間t作線性關(guān)系圖，斜率記作V1，代入式（1），計(jì)算出不同質(zhì)量濃度下的茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率Y。

式中：Y為清除率；V1為鄰苯三酚自氧化后加入樣品檢測(cè)吸收值；V0為鄰苯三酚自氧化后檢測(cè)吸收值。

2.2.2 不同類(lèi)型茶葉中茶多酚對(duì)自由基的清除率與質(zhì)量濃度線性關(guān)系

根據(jù)上述2.2.1的計(jì)算結(jié)果，以不同類(lèi)型茶葉中茶多酚的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，超氧自由基的清除率為縱坐標(biāo)作圖，得出茶葉中茶多酚對(duì)自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性方程，根據(jù)方程可算出當(dāng)清除率為50%時(shí)的茶多酚質(zhì)量濃度（IC50）值，IC50值可以作為衡量抗氧化物清除超氧自由基能力的一個(gè)指標(biāo)，其值越小，說(shuō)明清除自由基能力越強(qiáng)[16]。通過(guò)比較不同類(lèi)型茶葉中茶多酚的IC50大小，從而評(píng)價(jià)不同類(lèi)型茶葉的抗氧化能力。

3 結(jié)果與分析

3.1 鄰苯三酚自氧化反應(yīng)測(cè)定波長(zhǎng)

根據(jù)2.1.1的操作，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 鄰苯三酚自氧化吸收波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 Scanning image of catechol self-oxidation absorption wavelength

由圖1可得，鄰苯三酚法的原理為，鄰苯三酚在堿性環(huán)境下會(huì)發(fā)生自氧化，產(chǎn)生超氧自由基，加入抗氧化劑后超氧自由基與其反應(yīng)，超氧自由基的量減少，吸收峰降低。由此可知，鄰苯三酚在堿性環(huán)境下發(fā)生自氧化時(shí)，在320 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，故選擇320 nm作為鄰苯三酚自氧化的測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 鄰苯三酚自氧化反應(yīng)時(shí)間確定

根據(jù)2.1.2的操作，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出：隨著時(shí)間推進(jìn)，反應(yīng)體系在320 nm下吸光值逐漸增加，從35 min開(kāi)始，其每分種的吸光度值的增量開(kāi)始逐漸減小，到達(dá)50 min時(shí)，吸光度值趨于平衡，因而整個(gè)反應(yīng)過(guò)程的吸光度值A(chǔ)和反應(yīng)t的線性關(guān)系較差。而在前25 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，數(shù)據(jù)點(diǎn)均勻分布在趨勢(shì)線兩邊，其線性關(guān)系較好，故鄰苯三酚自氧化反應(yīng)時(shí)間為25 min。

圖2 鄰苯三酚體系自氧化反應(yīng)時(shí)間Fig.2 Autooxidation time of pyrogallol system

3.3 鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系速率的確定

根據(jù)2.1.2的操作，其結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系速率Fig.3 Rate of pyrogallol autooxidation reactionsystem

根據(jù)圖3，在25 min內(nèi)，吸光值A(chǔ)對(duì)反應(yīng)時(shí)間的線性關(guān)系良好，其方程斜率為鄰苯三酚自氧化速率V0（0.006 2），相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.999 7，而且每一段時(shí)間間隔內(nèi)，有色中間產(chǎn)物（半醌）都以穩(wěn)定的增量增加，且反應(yīng)速率趨于穩(wěn)定，故確定該反應(yīng)速率V0為0.006 2。

3.4 茶葉中不同類(lèi)型不同質(zhì)量濃度的茶多酚對(duì)超氧自由基的清除

3.4.1 綠茶中不同質(zhì)量濃度的茶多酚對(duì)超氧自由基的清除作用

根據(jù)2.2.1的操作，結(jié)果見(jiàn)圖4。

根據(jù)圖4中的線性方程斜率代入（1）式，可計(jì)算出不同質(zhì)量濃度的梵凈山綠茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率，分別為：Y0.04=29.03%、Y0.06=41.94%、Y0.08=50%和Y0.12=70.96%、Y0.14=92.00%。由此可知，隨著綠茶茶多酚質(zhì)量濃度的增加，其所含的茶多酚含量也增加，對(duì)超氧自由基的清除能力也越來(lái)越強(qiáng)。

圖4 綠茶中不同質(zhì)量濃度的茶多酚的反應(yīng)體系吸光值與時(shí)間線性關(guān)系Fig.4 Linear relation diagram of absorbance value and time in reaction system of green tea polyphenols with different mass concentrations

3.4.2 綠茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率與質(zhì)量濃度線性關(guān)系

別呦呦別過(guò)頭，朝司大愣子抿嘴一笑。司大愣子心里直癢癢，但媳婦的話是圣旨，他不敢違抗，只好戀戀不舍地走了。

根據(jù)2.2.2的操作，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 超氧自由基清除率與綠茶茶多酚質(zhì)量濃度線性關(guān)系Fig.5 Linear relationship between the scavenging rate of superoxide anion free radicals and the mass concentration of green tea polyphenols

由圖5線性方程可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.979 8，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布在趨勢(shì)線兩邊，線性關(guān)系良好，根據(jù)該圖線性擬合所得曲線的線性關(guān)系式Y(jié)=5.940 3X+0.045 1，當(dāng)清除率為50%時(shí)（將Y=50%代入線性方程）計(jì)算綠茶茶多酚質(zhì)量濃度（X值），即為IC50值為0.080 mg/mL。且綠茶茶多酚質(zhì)量濃度與超氧自由基清除率呈正相關(guān)，隨著綠茶茶多酚質(zhì)量濃度的增加，對(duì)超氧自由基的清除能力也越來(lái)越強(qiáng)。

3.4.3 白茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除作用

根據(jù)2.2.1的操作，結(jié)果見(jiàn)圖6。

根據(jù)圖6中的線性方程斜率代入（1）式，計(jì)算不同質(zhì)量濃度的梵凈山小醬白茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率為分別為：Y0.06=27.42%、Y0.08=38.71%、Y0.1=51.61%和Y0.14=69.35%、Y0.16=93.55%。由此可知，隨著白茶茶多酚濃度的增加，其所含的茶多酚含量也增加，對(duì)超氧自由基的清除能力也越來(lái)越強(qiáng)。

圖6 不同質(zhì)量濃度的白茶茶多酚中反應(yīng)體系吸光值與時(shí)間線性關(guān)系Fig.6 Linear relation diagram of absorbance value and time in reaction system of white tea polyphenols with different mass concentrations

3.4.4 白茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率與質(zhì)量濃度線性關(guān)系

根據(jù)2.2.2的操作，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7的線性方程可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.973 6，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布在趨勢(shì)線兩邊，線性關(guān)系良好，根據(jù)該圖線性擬合所得曲線的線性關(guān)系式Y(jié)=6.207 7X-0.109 1，當(dāng)清除率為50%時(shí)（將Y=50%代入線性方程），得梵凈山小醬白茶茶多酚的IC50為0.098 mg/mL。其值大于3.4.2梵凈山綠茶中茶多酚的IC50=0.080 mg/mL，從而得出綠茶的抗氧化能力大于白茶。然而，茶葉中具有抗氧化能力的物質(zhì)主要是茶多酚，其茶多酚含量的多少可直接影響茶葉抗氧化能力的強(qiáng)弱，由制作工藝可知，綠茶屬于未發(fā)酵茶，白茶經(jīng)過(guò)輕微的發(fā)酵處理，其茶多酚含量會(huì)有一定程度的損失。從而導(dǎo)致抗氧能力小于綠茶。

圖7 超氧自由基清除率與白茶茶多酚質(zhì)量濃度線性關(guān)系Fig.7 Linear relationship between superoxide free radical scavenging rate and white tea polyphenol mass concentration

3.4.5 紅茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除作用

根據(jù)2.2.1的操作，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 不同質(zhì)量濃度的紅茶茶多酚中反應(yīng)體系吸光值與時(shí)間線性關(guān)系Fig.8 Linear relation diagram of absorbance value and time in reaction system of black tea polyphenols with different mass concentrations

根據(jù)圖8中的線性方程斜率代入（1）式，計(jì)算不同質(zhì)量濃度的石阡苔茶（紅茶）茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率為分別為：Y0.1=20.97%、Y0.12=33.87%、Y0.14=46.76%和Y0.16=74.19%、Y0.18=90.32%，由此可知，隨著紅茶茶多酚濃度的增加，其所含的茶多酚含量也增加，對(duì)超氧自由基的清除能力也越來(lái)越強(qiáng)。

3.4.6 紅茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率與質(zhì)量濃度線性關(guān)系

根據(jù)2.2.2的操作，結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9的線性方程可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.979 4，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布在趨勢(shì)線兩邊，線性關(guān)系良好，根據(jù)該圖線性擬合所得曲線的線性關(guān)系式Y(jié)=8.951X-0.720 9，當(dāng)清除率為50%時(shí)（將Y=50%代入線性方程），得石阡苔茶（紅茶）茶多酚的IC50為0.136 mg/mL。其值大于3.4.2梵凈山綠茶中茶多酚的IC50=0.080 mg/mL，從而得出綠茶的抗氧化能力遠(yuǎn)大于紅茶，這是因?yàn)椴枞~中抗氧化能力主要成分是茶多酚，其茶多酚含量多少可直接影響茶葉抗氧化能力的強(qiáng)弱，由制作工藝可知，紅茶屬于全發(fā)酵茶，紅茶在制作過(guò)程中經(jīng)過(guò)深度發(fā)酵處理，其茶葉中茶多酚含量損失比較大，從而導(dǎo)致紅茶抗氧能力遠(yuǎn)小于綠茶。

圖9 超氧自由基清除率與紅茶茶多酚質(zhì)量濃度線性關(guān)系Fig.9 Linear superoxide free rate and mass of black tea polyphenols

3.4.7 苦丁茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除作用

根據(jù)2.2.1的操作，結(jié)果見(jiàn)圖10。

根據(jù)圖10中的線性方程斜率代入（1）式，計(jì)算不同質(zhì)量濃度的銅仁苦丁茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率為分別為：Y0.08=20.97%、Y0.1=33.87%、Y0.12=48.39%和Y0.14=66.13%、Y0.16=85.48%。由此可知，隨著苦丁茶茶多酚濃度的增加，其所含的茶多酚含量也增加，對(duì)超氧自由基的清除能力也越來(lái)越強(qiáng)。

3.4.8 苦丁茶茶多酚對(duì)超氧自由基的清除率與質(zhì)量濃度線性關(guān)系

根據(jù)2.2.2的操作，結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖10 不同質(zhì)量濃度的苦丁茶茶多酚中反應(yīng)體系吸光值與時(shí)間線性關(guān)系Fig.10 Linear relation diagram of absorbance value and time in reaction system of broadleaf holly leaf polyphenols with different mass concentrations

圖11 超氧自由基清除率與苦丁茶茶多酚質(zhì)量濃度線性關(guān)系Fig.11 Linear relationship between superoxide anion radical scavenging rate and the mass concentration of broadleaf holly leaf polyphenols

由圖11的線性方程可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 9，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布在趨勢(shì)線兩邊，線性關(guān)系良好，根據(jù)該圖線性擬合所得曲線的線性關(guān)系式Y(jié)=8.064ⅹ-0.458，當(dāng)清除率為50%時(shí)（將Y=50%代入線性方程），得到銅仁苦丁茶茶多酚的IC50為0.119 mg/mL。其值大于3.4.2梵凈山綠茶中茶多酚的IC50=0.080 mg/mL，從而得出綠茶的抗氧化能力大于苦丁茶，茶葉中抗氧化能力主要成分是茶多酚，苦丁茶的制作工藝與綠茶相似，都是未經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理，屬于未發(fā)酵茶，但由于苦丁茶含有大量的多糖、黃酮、皂苷、熊果酸、咖啡堿、氨基酸、維生素、揮發(fā)油等200多種成分[17]，提取過(guò)程產(chǎn)生的雜質(zhì)較多，對(duì)其中的茶多酚含量有一定程度影響。所以，苦丁茶的抗氧化能力小于綠茶。

4 結(jié)論

根據(jù)試驗(yàn)建立鄰苯三酚自氧化模型，其條件為：鄰苯三酚自氧化的檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm、濃度為0.4mg/mL、PBS緩沖液pH=8.0、V（鄰苯三酚溶液）：V（PBS緩沖液）=0.1∶5、反應(yīng)時(shí)間25 min，測(cè)得4種不同類(lèi)型茶葉中[梵凈山綠茶、梵凈山小醬白茶、銅仁苦丁茶、石阡苔茶（紅茶））茶多酚清除超氧自由基能力的IC50分別為：0.08、0.098、0.119、0.136 mg/mL，即 4 種類(lèi)型茶葉抗氧化能力依次為：梵凈山綠茶>梵凈山小醬白茶>銅仁苦丁茶>石阡苔茶（紅茶）。由于茶葉中主要的抗氧化活性物質(zhì)是茶多酚，茶葉的發(fā)酵程度不同，抗氧化活性物質(zhì)茶多酚含量也存在較大差異[18]。即茶葉中的茶多酚含量的大小直接影響茶葉的抗氧化能力，梵凈山綠茶為不發(fā)酵茶，保留了茶葉中原有的天然物質(zhì)，其所含的茶多酚含量會(huì)比其他類(lèi)型茶葉茶多酚含量高很多。因此，綠茶的抗氧化能力最強(qiáng)；梵凈山小醬白茶為微發(fā)酵茶，經(jīng)過(guò)輕微的發(fā)酵工藝處理，所含的茶多酚會(huì)有一定程度的損失，使抗氧化能力降低；紅茶為全發(fā)酵茶，在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)，茶多酚含量會(huì)有很大程度的損失，其抗氧化能力有很大程度減弱；苦丁茶制作工藝和綠茶相似，但由于含有大量的多酚，多糖、黃酮、皂苷、熊果酸、咖啡堿、氨基酸、維生素、揮發(fā)油等200多種成分，對(duì)其中的茶多酚含量有一定程度影響。從而影響苦丁茶中茶多酚的抗氧化能力，由此可知，茶葉的制作工藝不同，其主要成分茶多酚的抗氧化能力不同，這為后續(xù)的應(yīng)用研究提供一定的參考依據(jù)。