劉遠(yuǎn)興 周坤元 王士中 謝運(yùn)泉 梁昊

急性缺血性腦卒中(急性腦梗死)是最常見的卒中類型，是由于腦部血管阻塞導(dǎo)致大腦缺血缺氧進(jìn)而壞死[1]，占我國(guó)腦卒中的69.6%～70.8%[2]。急性期的時(shí)間劃分尚不統(tǒng)一，一般指發(fā)病后2周內(nèi)，輕型1周內(nèi)，重型1個(gè)月內(nèi)。我國(guó)住院急性缺血性腦卒中患者發(fā)病后1個(gè)月內(nèi)病死率約為2.3%～3.2%，3個(gè)月時(shí)病死率9.0%～9.6%，致死/殘疾率為34.5%～37.1%，1年病死率14.4%～15.4%，致死/殘疾率33.4%～33.8%[2]。腦卒中的發(fā)生，是先天和后天因素共同作用的結(jié)果，其中基因的表達(dá)非常關(guān)鍵。有多項(xiàng)研究表明Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)與腦卒中的發(fā)生、發(fā)展存在顯著關(guān)聯(lián)[3-4]。rs10759932[5]和rs11536879[6]已證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病存在明顯相關(guān)性。團(tuán)隊(duì)前期也通過Meta分析得出TLR4基因多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)rs10759932、rs11536891、rs11536879與缺血性腦卒中再灌注損傷的發(fā)生相關(guān)[7]。此外，不同人種中TLR4基因rs1927914位點(diǎn)上的T等位基因?qū)θ毖阅X卒中的易感性不同，歐美人種T等位基因高時(shí)，更易出現(xiàn)缺血性腦卒中，但對(duì)于亞洲人口這一結(jié)論尚缺乏有效證據(jù)[8]。為此，我們檢測(cè)梅州地區(qū)缺血性腦卒中患者和健康對(duì)照人群TLR4基因rs10759932、rs11536879、rs11536891、rs1927914 4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型，分析其與缺血性腦卒中的相關(guān)性，期望為腦卒中患者的防治提供臨床依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 觀察對(duì)象收集2018年1月1日至2018年7月31日在中山大學(xué)附屬梅州醫(yī)院(廣東省梅州市人民醫(yī)院)住院治療的梅州市籍貫首次突發(fā)缺血性腦卒中患者為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)癥狀、體查、CT/MRI影像學(xué)檢查等確診，符合腦卒中TOAST病因分型和《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014》[9]；(2)受試者或其監(jiān)護(hù)人同意簽署知情同意書；(3)患者籍貫為梅州地區(qū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因外傷、心律失常、腦血管畸形、腫瘤、血液疾病引起的腦卒中患者，特別注意剔除大動(dòng)脈粥樣硬化型與心源性栓塞造成的缺血性腦卒中患者；(2)患者無法配合或資料收集不全者。

收集同期在該院體檢中心的梅州市籍貫體檢健康者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)體檢確認(rèn)無腦卒中病史；(2)血壓、血糖、血常規(guī)、肝腎功能均正常；(3)受試者同意簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)體檢發(fā)現(xiàn)曾患有或正患有嚴(yán)重疾病，如心梗、心衰、癌癥等；(2)有精神病史；(3)阿爾茨海默病。

病例組共納入病例194例，剔除資料缺失5例、腦部腫瘤2例、DNA樣本不合格1例，共186例樣本進(jìn)入研究，其中男127例、女59例，發(fā)病年齡37～86歲，平均(66.8±11.0)歲；對(duì)照組共收納入健康人202位，剔除資料缺失6位、患有其他心腦血管相關(guān)疾病2位，共194位健康樣本進(jìn)入研究，其中男101例、女93例，發(fā)病年齡40～81歲，平均(64.6±19.1)歲。病例組和對(duì)照組在性別、發(fā)病年齡、吸煙史、飲酒史等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑及設(shè)備核酸自動(dòng)提取儀(AU1001，BioTeKe Corpration)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher，USA)，Smart view pro 1100凝膠電泳成像儀、MP-300V 電泳儀(Major science)，ABI veriti-384 PCR儀(ABI)，384-well SpectroCHIP? bioarray芯片、MassARRAY Nanodispenser 點(diǎn)樣機(jī)(RS1000，BIT Group)、MassARRAY Analyzer 4.0質(zhì)譜儀(MA4.2，Agena)等。ddH2O(ABI)、擴(kuò)增引物和延伸引物混合物(Thermo)，25 mmol/L dNTP混合物、HotStar Taq(5 U/μL)、SAP Buffer、SAP Enzyme、iPLEX Buffer Plus、iPLEX Termination mix及iPLEX Enzyme(Agena，Inc)。

1.3 方法

1.3.1樣品采集與準(zhǔn)備：納入研究的受試者均清晨空腹抽取5 mL靜脈全血，以乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，冷凍保存。檢測(cè)時(shí)，加入人紅細(xì)胞裂解液，劇烈震蕩 3 min，以12 000 r/min、離心半徑15 cm離心30 s，棄上清，沉淀獲取白細(xì)胞，提取血樣中的DNA。使用NanoDrop2000進(jìn)行吸光度值檢測(cè)，1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，DNA質(zhì)檢合格(瓊脂糖電泳須有大于 10 kb 的明亮單一條帶，且無 RNA 和蛋白污染)，轉(zhuǎn)移至96孔板，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 4個(gè)TLR4 SNP位點(diǎn)引物序列

1.3.2基因分析：(1)引物設(shè)計(jì)及合成：在NCBI網(wǎng)頁(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中輸入4個(gè)SNP位點(diǎn)的名稱，按照dbSNP batch reportor格式顯示，并在My agena網(wǎng)站中獲取基因序列。結(jié)合公開發(fā)表過的關(guān)于該基因或該位點(diǎn)的文獻(xiàn)并采用 AssayDesigner3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物(表1)，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

(2)基因分型檢測(cè)：對(duì)所有樣本的基因位點(diǎn)通過Agena MassArray系統(tǒng)進(jìn)行基因分型檢測(cè)。首先進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，繼而進(jìn)行產(chǎn)物堿性磷酸酶處理，之后進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，最后進(jìn)行樹脂純化和芯片點(diǎn)樣。將點(diǎn)樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，檢測(cè)結(jié)果使用MassARRAY TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，經(jīng)兩人核對(duì)檢查數(shù)據(jù)文件的完整無誤(各SNP的數(shù)據(jù)不為空，質(zhì)譜無顯著干擾、缺失，能明確分型)后將結(jié)果保存。

1.3.3數(shù)據(jù)分析：(1)可靠性分析：利用MassARRAY TYPER4.0軟件根據(jù)DNA產(chǎn)物峰面積大小計(jì)算得到SNP位點(diǎn)所有分型點(diǎn)狀圖，正常聚類圖中2個(gè)純合子分型根據(jù)產(chǎn)物峰高分別在靠近橫、縱軸聚類，在二者之間單獨(dú)聚類的一組為雜合子，以此來確定SNP檢測(cè)的可靠性。

(2)群體代表性分析：計(jì)算各組TLR4的4個(gè)位點(diǎn)基因型頻率，經(jīng)Haploview 4.2軟件計(jì)算其是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡定律及最小等位基因頻率(MAF)，以H-W方法P值及MAF值均>0.05認(rèn)為符合群體代表性。

(3)回歸分析及相關(guān)性分析：將基因型、發(fā)病年齡、性別、吸煙史納入Logistic分析，確定基因型是否為危險(xiǎn)因素。將病例組SNP基因型與發(fā)病年齡進(jìn)行相關(guān)性分析，確定哪種基因型與發(fā)病年齡相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；位點(diǎn)基因型資料以頻數(shù)表示，兩組間SNP表達(dá)差異比較采用χ2檢驗(yàn)；采用二分類Logistic 回歸分析(經(jīng)年齡、性別、吸煙史、飲酒史校正)統(tǒng)計(jì)分析各SNP位點(diǎn)基因型與患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，計(jì)算值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)；以Spearman秩相關(guān)對(duì)SNP位點(diǎn)各基因型與年齡進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNP可靠性檢測(cè)4種SNP聚類圖中2個(gè)純合子分型根據(jù)產(chǎn)物峰高分別在靠近橫、縱軸聚類，在二者之間單獨(dú)聚類的一組為雜合子，均為正常聚類圖，表明檢測(cè)結(jié)果可靠(圖 1)。

圖1 SNP分型聚類圖

2.2 H-W平衡和MAF檢驗(yàn)rs10759932位點(diǎn)有效樣本374份，檢出率98.42%；rs11536879位點(diǎn)有效樣本376份，檢出率98.95%；rs11536891位點(diǎn)有效樣本374份，檢出率98.42%；rs1927914位點(diǎn)有效樣本366份，檢出率96.32%。所有基因位點(diǎn)H-W平衡檢驗(yàn)P值和MAF值均大于0.05。提示樣本來自一個(gè)穩(wěn)定的群體，具有群體代表性。詳見表 2。

表2 H-W平衡和MAF檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 病例組與對(duì)照組中SNP位點(diǎn)各基因型分布比較TLR4 rs10759932 T/C基因型頻率分布(χ2=3.692，P=0.158)、rs11536879 A/G基因型頻率分布(χ2=0.615，P=0.735)和rs11536891 T/C基因型頻率分布(χ2=1.975，P=0.373)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs1927914 A/G基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.267P=0.010)，對(duì)照組GG頻率顯著高于病例組(表3)。

二分類logistic回歸分析顯示，rs1927914 GG基因型發(fā)生腦梗死風(fēng)險(xiǎn)的概率是AA型的37.7%(校正OR=0.377，95%CI為0.189～0.750，P=0.005)；其余SNP位點(diǎn)基因型統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

2.4 病例組SNP位點(diǎn)各基因型與發(fā)病年齡的相關(guān)性rs11536891基因型與發(fā)病年齡存在負(fù)相關(guān)(r=-0.156，P=0.035)，表明TC/CC基因型容易出現(xiàn)早發(fā)缺血性腦卒中。其余SNP位點(diǎn)基因型與發(fā)病年齡均無相關(guān)性(表5)。

表3 病例組與對(duì)照組SNP位點(diǎn)各基因型分布比較(n)

表4 SNP位點(diǎn)各基因型二分類Logistic分析結(jié)果

表5 病例組SNP位點(diǎn)各基因型與發(fā)病年齡的相關(guān)性結(jié)果

3 討論

缺血性腦卒中的基因多態(tài)性的研究很大程度上受限于樣本的例數(shù)大小和其遺傳異質(zhì)性。在目前已研究的相關(guān)基因多態(tài)性中，其遺傳多態(tài)性亦存在明顯的種族差異性，盡管基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究成果不盡一致，其分子遺傳學(xué)研究對(duì)腦梗死的基因治療以及腦梗死疾病易感人群的檢測(cè)和早期防治提供依據(jù)[10]。缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，炎性反應(yīng)在腦損傷的形成機(jī)制中起重要作用，既往已明確Toll樣受體可以參與多種炎性細(xì)胞及分子的識(shí)別，是誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因素；其中，TLR4廣泛分布于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元中，參與腦卒中后炎性腦損傷的病理過程。腦損傷后壞死細(xì)胞中釋放的熱休克蛋白等能激發(fā)TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，而進(jìn)一步損傷的神經(jīng)元產(chǎn)生的熱休克蛋白60等能激活更多的TLR4及神經(jīng)毒性受體形成惡性循環(huán)[11]。腦缺血時(shí)，TLR4顯著升高，與相應(yīng)配體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成和釋放，通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途徑介導(dǎo)炎性反應(yīng)及凋亡[12]。

已有研究探討了中國(guó)北方漢族人群基因多態(tài)性與缺血性腦卒中TOAST亞型的關(guān)系：rs1927911位點(diǎn)TT基因型頻率在LAA組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.652，95%CI=0.436～0.974，P=0.037)。rs2149356位點(diǎn)A等位基因頻率在LAA組明顯高于對(duì)照組(OR=1.413，95%CI=1.125～1.790，P=0.004)；rs1927914位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在LAA組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。然而，Gu等[14]的研究則發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)男性缺血性腦卒中患者的rs1927914基因多態(tài)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其相關(guān)性如下：加性模型(additive model，AA + GGvs. AG)中患者OR(95%CI)為0.81(0.67～0.99)，P=0.039；等位基因模型(allele model，Avs. G)中患者OR(95%CI)為0.81(0.66～0.99)，P=0.037。這表明中國(guó)南、北方的漢族人群在缺血性腦卒中的發(fā)生機(jī)制上存在差異，也表明該病的發(fā)生是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果。本研究 也顯示，rs1927914 A/G基因型頻率分布在病例組和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.267，P=0.010)，病例組GG頻率顯著低于對(duì)照組。rs1927914 GG基因型發(fā)生腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的概率是AA型的37.7%(校正OR=0.377，95%CI=0.189～0.750，P=0.005)。這與Gu等的研究報(bào)道一致。同時(shí)，本研究中首先對(duì)研究人群進(jìn)行了H-W平衡和MAF檢驗(yàn)，以確保所納入的群體具備代表性。而且，為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，剔除了會(huì)嚴(yán)重干擾結(jié)果的病例。本研究還對(duì)所有檢測(cè)樣本進(jìn)行了聚類圖繪制，所有SNP位點(diǎn)的聚類圖均顯示出了良好的可靠性。

腦卒中疾病發(fā)生與年齡有顯著相關(guān)性，年齡越大，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越高[15]。高齡腦卒中患者可能只是衰老的表現(xiàn)，與基因因素相關(guān)性小，80歲以上的高齡腦卒中患者和40多歲的腦卒中患者發(fā)病機(jī)制可能不完全相同，年輕患者發(fā)生缺血性中風(fēng)對(duì)社會(huì)和家庭帶來的危害更大，可能長(zhǎng)期致殘，生活質(zhì)量下降。本研究顯示病例組rs11536891基因型與發(fā)病年齡存在負(fù)相關(guān)，即TC/CC基因型容易出現(xiàn)早發(fā)缺血性腦卒中。當(dāng)然，本研究也存在很多不足，如病例數(shù)量不夠大，可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；在檢測(cè)過程中，某些樣品檢測(cè)失敗，造成檢出率無法達(dá)到100%，可能存在數(shù)據(jù)偏倚。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，rs1927914基因位點(diǎn)基因型與缺血性腦卒中的發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)，G為該基因位點(diǎn)的保護(hù)基因；rs11536891基因型與缺血性腦卒中的發(fā)病年齡存在負(fù)相關(guān)，TC/CC基因型更容易出現(xiàn)早發(fā)缺血性腦卒中。目前流行病學(xué)和動(dòng)物模型研究均表明腦梗死是遺傳性疾病，但基因和環(huán)境的共同作用對(duì)腦卒中發(fā)病影響仍待研究。此外，與腦卒中相關(guān)的基因與發(fā)病年齡的相關(guān)性仍需要深入探討，以便延緩腦卒中發(fā)病或及時(shí)救治。