杜心恬， 宋 馨， 劉欣欣， 夏永軍， 艾連中， 熊智強(qiáng)

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心， 上海 200093

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)是一種常見的益生乳酸菌，廣泛存在于乳制品、自然界和人體中[1]。其中，LC2W是一株高產(chǎn)胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)的干酪乳桿菌，其EPS不僅可以作為食品添加劑改變產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)，也能作為一種“粘性”發(fā)酵劑改善產(chǎn)品風(fēng)味[2]。LC2W的EPS還具有降血壓、腸道菌群維穩(wěn)和激活免疫應(yīng)答等益生功效。干酪乳桿菌LC2W中EPS結(jié)構(gòu)解析與產(chǎn)量?jī)?yōu)化等研究比較深入。例如，AI等完成了LC2W的EPS的分離純化，解析了其結(jié)構(gòu)[3]和生物合成途徑[4]。LI等[2]通過(guò)代謝工程方法調(diào)控LC2W中EPS合成，使EPS產(chǎn)量提高了75%。

EPS的生物合成一般由eps基因簇控制，包括調(diào)控、鏈長(zhǎng)、重復(fù)單元合成、聚合和輸出等基因[5]。SONG等[6]通過(guò)Crispr/Cas9基因編輯技術(shù)鑒定出干酪乳桿菌LC2W中3個(gè)影響EPS合成的關(guān)鍵基因。但LC2W中EPS生物合成研究仍有欠缺，特別是控制轉(zhuǎn)錄起始及速率的重要元件啟動(dòng)子尚未鑒定，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控亟待研究[7]。生物信息學(xué)方法可以利用啟動(dòng)子保守序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)信息，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子位置。RT-PCR[8]和5′-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(5'-RACE)[9]等實(shí)驗(yàn)方法可以鑒定啟動(dòng)子區(qū)域。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)干酪乳桿菌LC2W中eps基因簇的潛在啟動(dòng)子區(qū)域，利用RT-PCR方法鑒定啟動(dòng)子，以期為干酪乳桿菌LC2W的EPS合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所用的菌株干酪乳桿菌LC2W由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2試劑與引物

本實(shí)驗(yàn)所用的引物由生工生物有限公司合成(表1)?；蚪M提取試劑盒購(gòu)自Axygen；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自生工生物有限公司；Phanta超保真DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司； DNA Marker、DNase I(RNA Free)酶試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara。

1.1.3培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)干酪乳桿菌；胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，檸檬酸銨 2 g/L，磷酸氫二鉀 2 g/L，乙酸鈉 5 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，吐溫80 1 ml/L。固體培養(yǎng)基加瓊脂粉20 g/L。

表1 本研究所用的引物

1.1.4儀器與設(shè)備

移液槍，購(gòu)自Eppendorf公司；冷凍離心機(jī)，購(gòu)自Sigma；超微量核酸蛋白定量?jī)xNanodrop 2000，購(gòu)自Thermo Fisher；PCR儀、電泳儀和凝膠成像儀，購(gòu)自Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1基因組抽提

挑取平板劃線的干酪乳桿菌LC2W單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中活化12 h，以2%的比例接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h～16 h后，離心收集菌體。根據(jù)Axygen基因組提取試劑盒說(shuō)明書步驟操作，提取LC2W基因組。

1.2.2RT-PCR鑒定共轉(zhuǎn)錄單元

將干酪乳桿菌LC2W液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體，按照天根RNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟操作提取RNA。通過(guò)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用cDNA在相鄰的基因間隔區(qū)進(jìn)行PCR，篩選干酪乳桿菌eps基因簇中的共轉(zhuǎn)錄單元。

以干酪乳桿菌LC2W的DNA、RNA和cDNA為模板，分別與eps基因簇上的所有基因間隔區(qū)的引物orf2169-orf2170-F/R、orf2170-orf2171-F/R、orf2171-orf2172-F/R、orf2172-orf2173-F/R、orf2173-orf2174-F/R、orf2174-orf2175-F/R、orf2175-orf2176-F/R、orf2176-orf2177-F/R、orf2177-orf2178-F/R、orf2178-orf2179-F/R、orf2179-orf2180-F/R、orf2180-orf2181-F/R、orf2181-orf2182-F/R、orf2182-orf2183-F/R、orf2183-orf2184-F/R、orf2184-orf2185-F/R、orf2185-orf2186-F/R、orf2186-orf2187-F/R、orf2187-orf2188-F/R、orf2188-orf2189-F/R、orf2189-orf2190-F/R共21對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中DNA組為陽(yáng)性對(duì)照，RNA組為陰性對(duì)照，cDNA組為實(shí)驗(yàn)組。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)為50 uL體系(表2)，擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；Tm(引物退火溫度)30 s；68 ℃，1 min/kb，循環(huán)30次；68 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶，篩選共轉(zhuǎn)錄單元，鑒定啟動(dòng)子區(qū)域。

表2 PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與討論

2.1 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)eps基因簇啟動(dòng)子區(qū)域

干酪乳桿菌LC2W前期已完成基因組全測(cè)序，將干酪乳桿菌LC2W預(yù)測(cè)的eps基因簇與乳酸菌中參與EPS生物合成的已知基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)LC2W中eps基因簇由21個(gè)基因組成(圖1)，且預(yù)測(cè)得到該基因簇的各基因功能[6](表3)。

eps基因簇通常以多個(gè)共轉(zhuǎn)錄單元組成，啟動(dòng)子通常位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的非編碼區(qū)，自身不轉(zhuǎn)錄mRNA[10]。通過(guò)對(duì)eps基因簇上的共轉(zhuǎn)錄單元進(jìn)行篩選，可以確定啟動(dòng)子存在的位置[8]。啟動(dòng)子存在于每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，利用NCBI ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)LC2W中eps基因簇操縱子和CDS(基因編碼區(qū))，推測(cè)潛在啟動(dòng)子區(qū)域(表3)。由于LC2W_2171-LC2W_2175基因功能不明，所以暫未列入預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示LC2W中eps基因簇預(yù)測(cè)存在5個(gè)操縱子，其余皆為單基因轉(zhuǎn)錄單位(圖1)。結(jié)合基因功能預(yù)測(cè)結(jié)果，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析共得到8個(gè)潛在啟動(dòng)子區(qū)域，分別命名為P2169-2170、P2179-2180、P2180-2181、P2182-2183、P2183-2184、P2185-2186、P2187-2188、P2189-2190。(圖1)

注：操縱子區(qū)域?yàn)橥担瑔位蜣D(zhuǎn)錄單元為獨(dú)立色系。圖1 干酪乳桿菌LC2W中預(yù)測(cè)的eps 基因簇及啟動(dòng)子預(yù)測(cè)

表3 干酪乳桿菌LC2W中eps基因簇中操縱子的預(yù)測(cè)

2.2 RT-PCR鑒定eps基因簇啟動(dòng)子區(qū)域

為驗(yàn)證上述生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)，因共轉(zhuǎn)錄單元mRNA的連續(xù)性，設(shè)計(jì)了22對(duì)基因間隔區(qū)間的引物，通過(guò)RT-PCR分析證實(shí)eps基因簇上的潛在共轉(zhuǎn)錄單元。若cDNA與引物的PCR產(chǎn)物有條帶，則相鄰基因共轉(zhuǎn)錄，一般不存在啟動(dòng)子；若無(wú)條帶，則相鄰基因獨(dú)立轉(zhuǎn)錄，是潛在啟動(dòng)子區(qū)域。其中，DNA組為陽(yáng)性對(duì)照，RNA組為陰性對(duì)照。

RT-PCR結(jié)果表明(圖2)，干酪乳桿菌LC2W的eps基因簇中存在5個(gè)操縱子，其余2個(gè)基因皆為單基因轉(zhuǎn)錄單位。基因簇上存在個(gè)6個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，分別為P2169-2170、P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176、P2185-2186、P2189-2190。與生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的結(jié)果相比，有5個(gè)潛在啟動(dòng)子區(qū)域P2179-2180、P2180-2181、P2182-2183、P2183-2184和P2187-2188不存在啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，而P2169-2170、P2185-2186、P2189-2190是3個(gè)正確的啟動(dòng)子。此外，基因簇上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)未被預(yù)測(cè)到的啟動(dòng)子P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176。不同細(xì)菌啟動(dòng)子基因的差異性會(huì)影響預(yù)測(cè)結(jié)果，這可能是造成本研究通過(guò)RT-PCR鑒定得到的啟動(dòng)子與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果不同的重要原因[11]。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析干酪乳桿菌LC2W的eps基因簇，通過(guò)基因功能和操縱子的預(yù)測(cè)分析，推測(cè)出8個(gè)潛在啟動(dòng)子區(qū)域。利用RT-PCR方法篩選eps基因簇中的共轉(zhuǎn)錄單元，鑒定出6個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域P2169-2170、P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176、P2185-2186、P2189-2190，與預(yù)測(cè)結(jié)果略有差異。啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵元件，本研究干酪乳桿菌LC2W中eps基因簇啟動(dòng)子的鑒定，對(duì)后續(xù)EPS生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理研究提供幫助。