大豆GmGolS基因的原核表達(dá)及抗旱性分析

邱爽 何佳琦 李銘楊 翟瑩

摘要：肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，簡(jiǎn)稱(chēng)GolS）是棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡(jiǎn)稱(chēng)RFOs）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR從大豆葉片cDNA中擴(kuò)增得到編碼肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS，再將GmGolS基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28上，然后將載體導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，對(duì)其進(jìn)行異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG）誘導(dǎo)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)SDS-PAGE）結(jié)果表明，在誘導(dǎo)時(shí)間為3 h、IPTG濃度為0.1 mmol/L的條件下，可以獲得大量重組蛋白，分子量約為40 ku。對(duì)表達(dá)GmGolS蛋白的大腸桿菌進(jìn)行抗旱性分析的結(jié)果顯示，GmGolS基因在大腸桿菌中的過(guò)表達(dá)降低了重組菌的生活力，使其對(duì)干旱脅迫更加敏感。

關(guān)鍵詞：大豆;肌醇半乳糖苷合成酶;原核表達(dá);抗旱性

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.101?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）14-0061-04

植物在遭受不良環(huán)境條件脅迫后，可以誘導(dǎo)自身合成大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)增加植物細(xì)胞的滲透壓，提高其抵抗脅迫的能力，從而維持其自身的代謝和生長(zhǎng)發(fā)育。棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡(jiǎn)稱(chēng)RFOs）就是這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的典型代表，它們是高等植物中含量?jī)H次于蔗糖的一類(lèi)可溶性糖。肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，簡(jiǎn)稱(chēng)GolS）是RFOs生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[1]。目前已有大量關(guān)于GolS基因受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的報(bào)道，且超量或異源表達(dá)該基因可以不同程度地提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。擬南芥中含有7種GolS基因，其中AtGolS1、AtGolS2基因可以被干旱、高鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，AtGolS3基因可以被低溫脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[2]。在A(yíng)tGolS1、AtGolS2基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，肌醇半乳糖苷、棉子糖含量均增加，使得植物對(duì)氧化脅迫的耐受能力增強(qiáng)[3]。小麥TaGolS3基因的表達(dá)受到外源脫落酸（abscisic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)ABA）、低溫、鹽脅迫誘導(dǎo)，同時(shí)還能被ZnCl2、CuCl2誘導(dǎo)，通過(guò)對(duì)活性氧的調(diào)控，轉(zhuǎn)基因植株能夠表現(xiàn)出對(duì)鋅脅迫的耐受性[4]。GolS基因的抑制表達(dá)則使植物對(duì)脅迫更加敏感。例如AtGolS1基因的T-DNA插入突變體植株與野生型植株相比，抗熱性明顯降低[5]。GolS基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種植物轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控其表達(dá)，如HSF、DREB和WRKY等[6-8]。

大豆（Glycine max L.）是世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物之一，不僅是人類(lèi)獲取蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的主要來(lái)源，同時(shí)也是重要的牲畜飼料。大豆中GolS基因的功能鑒定對(duì)于大豆棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡(jiǎn)稱(chēng)RFOs）代謝途徑及大豆抗逆機(jī)制的研究都具有重要意義。但到目前為止，有關(guān)大豆中肌醇半乳糖苷合成酶的研究非常少。本研究將大豆中1個(gè)編碼肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化與抗旱性分析，以期為該基因的功能研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)于2018年10月在黑龍江省齊齊哈爾市齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種研究室進(jìn)行。大豆品種北豆9號(hào)、原核表達(dá)載體pET28及大腸桿菌DH5α菌株、Rosetta（DE3）菌株均由齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種研究室提供?？寺≥d體pMD18-T、各種限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶、DNA marker DL 2000、Ex Taq、RNAiso Plus購(gòu)自TaKaRa公司;低分子量蛋白marker、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Novoprotein公司;質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆葉片總RNA的提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄 使用RNAiso Plus提取0.1 g大豆葉片總RNA，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。用瓊脂糖凝膠電泳和D260 nm/280 nm檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱(chēng)NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索編碼大豆GolS基因的序列。利用Primer 5軟件，根據(jù)GmGolS基因的編碼序列設(shè)計(jì)引物。上游引物序列為5′-GGAATTCATGGCTCCTAATATCACCACTG-3′，下游引物序列為5′-TGCGGTCGACTTAAGCAGCAGATGGGGC-3′，上游、下游引物序列中的下劃線(xiàn)部分分別代表EcoRⅠ、SalⅠ 酶切位點(diǎn)。以合成的第一鏈cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增GmGolS基因（退火溫度為56 ℃）。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的基因片段并連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定，挑取陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的含有目的基因的克隆載體擴(kuò)繁并提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切，同時(shí)將載體pET28用EcoRⅠ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，通過(guò)DNA連接酶將酶切片段定向連接到pET28載體上，再用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定后，挑取陽(yáng)性克隆，保存菌種備用。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取pET28-GmGolS陽(yáng)性克隆和pET28空載體克隆至添加 50 mg/L 卡那霉素和15 mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1 ∶100的體積比轉(zhuǎn)接至20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4左右時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalacto pyranoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG），分別誘導(dǎo)培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h后，取樣并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)SDS-PAGE），確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。使用同樣的方法，分別加入終濃度為0.1、0.2、0.3 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.2.5 表達(dá)GmGolS蛋白的大腸桿菌干旱脅迫分析 將pET28-GmGolS重組大腸桿菌及含有pET28空載體的大腸桿菌按照優(yōu)化后的最優(yōu)條件（誘導(dǎo)時(shí)間為3 h、IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)后的菌液均稀釋至同一濃度（D600 nm=0.8），各取10 μL，稀釋10 000倍，取 100 μL 分別涂布到不含PEG-8000和含1% PEG-8000的固體LB培養(yǎng)基上（含有50 mg/L卡那霉素、15 mg/L氯霉素），于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，觀(guān)察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmGolS基因的克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得編碼大豆GolS基因的序列GmGolS，其GenBank登錄號(hào)為NM001251098。以大豆葉片cDNA為模板，擴(kuò)增得到987 bp的GmGolS基因全序列（圖1），經(jīng)測(cè)序與原序列一致。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GmGolS基因編碼含有328個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量大小為38.03 ku。

2.2 GmGolS基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)酶切位點(diǎn)將GmGolS基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28上，質(zhì)粒雙酶切和菌液PCR結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)GmGolS基因已成功連接至pET28載體上并獲得了含有重組質(zhì)粒的Rosetta（DE3）菌株。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

為了大量獲得GmGolS重組蛋白，對(duì)IPTG誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果（圖3）表明，3～8 泳道與對(duì)照（空載體及未誘導(dǎo)菌株）相比，在約 40 ku 處有目的蛋白的表達(dá)。GmGolS蛋白分子量為 38.03 ku，加上6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，融合蛋白分子量約為40 ku，因此表達(dá)的重組蛋白大小與預(yù)期結(jié)果相符，但在對(duì)照中無(wú)此蛋白表達(dá)，表明GmGolS基因已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達(dá)。由圖3還可以看出，IPTG誘導(dǎo)1 h時(shí)已出現(xiàn)重組蛋白，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組蛋白的表達(dá)量隨之增加，到3 h時(shí)達(dá)到最大值，之后差別不大。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中將誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)為3 h。

圖4是在不同IPTG誘導(dǎo)濃度下重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果?？梢钥闯觯?dāng)IPTG濃度為01 mmol/L時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量已達(dá)到最大值，并且不同濃度間的差別不大。由此可知，不同IPTG濃度在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)差異不明顯，IPTG誘導(dǎo)濃度選擇0.1 mmol/L即可。

2.4 表達(dá)GmGolS蛋白的大腸桿菌干旱脅迫分析

為了選擇最佳誘導(dǎo)條件，設(shè)IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，對(duì)重組菌誘導(dǎo)3 h后進(jìn)行抗旱性分析。如圖5所示，在未添加PEG-8000的培養(yǎng)基上，與轉(zhuǎn)化空載體pET28的大腸桿菌相比，表達(dá)GmGolS蛋白的重組大腸桿菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制。在含有1% PEG-8000的培養(yǎng)基上，表達(dá)GmGolS蛋白的大腸桿菌的生長(zhǎng)繼續(xù)受到抑制，雖然含有對(duì)照空載體的大腸桿菌生長(zhǎng)也受到了抑制，但其活性仍明顯高于表達(dá)GmGolS蛋白的大腸桿菌。由此可見(jiàn)，GmGolS蛋白在大腸桿菌中的過(guò)表達(dá)降低了重組菌的生活力，使其對(duì)干旱脅迫更加敏感。

3 討論

肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，簡(jiǎn)稱(chēng)GolS）催化尿嘧啶二磷酸（uridine diphosphate，簡(jiǎn)稱(chēng)UDP）-半乳糖和肌醇合成肌醇半乳糖苷的反應(yīng)，是棉子糖代謝通路中物質(zhì)合成的第一步，也是棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡(jiǎn)稱(chēng)RFOs）合成的限速步驟[1，9]。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，GolS基因在植物的抗逆反應(yīng)、光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)和種子發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[10]。進(jìn)一步研究GolS基因的表達(dá)與GolS酶活性、RFOs的積累及植物抗逆性的關(guān)系，能夠?yàn)橹参锟鼓嫘缕贩N的培育提供更全面的理論基礎(chǔ)。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，融合蛋白在該系統(tǒng)中的表達(dá)結(jié)果可受多種因素影響，如誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等[11-12]。本試驗(yàn)將大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS構(gòu)建到原核表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及條件優(yōu)化（IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化），結(jié)果顯示，該基因能夠在大腸桿菌中表達(dá)，融合蛋白分子量大小約為40 ku。但是本研究結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響不大，這與前人的某些試驗(yàn)結(jié)果相似[13-14]。筆者也嘗試對(duì)GmGolS重組蛋白進(jìn)行純化回收，但表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體的形式存在（結(jié)果未列出）。推測(cè)出現(xiàn)這種情況的原因可能是溫度過(guò)高等，使蛋白合成速度過(guò)快，導(dǎo)致蛋白質(zhì)來(lái)不及進(jìn)行折疊及二硫鍵的配對(duì)，或是由于蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合而使重組蛋白無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度[15-16]。前人曾將木薯、沙冬青的GolS基因在大腸桿菌中進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果表明，GolS基因過(guò)表達(dá)的大腸桿菌分別獲得了耐旱性及耐寒性[17-18]。但在本試驗(yàn)中，GmGolS基因過(guò)表達(dá)的大腸桿菌干旱脅迫結(jié)果與范潔等的研究結(jié)果[17]不一致，推測(cè)可能由于GmGolS重組蛋白在大腸桿菌中的超量表達(dá)破壞了大腸桿菌的生理及代謝平衡，導(dǎo)致其對(duì)干旱脅迫更加敏感。說(shuō)明由于表達(dá)系統(tǒng)不同，導(dǎo)致部分真核生物的基因不能在原核生物中進(jìn)行功能鑒定。本研究結(jié)果為進(jìn)一步的GmGolS蛋白理化性質(zhì)及基因功能研究打下了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用RT-PCR方法，從大豆葉片cDNA中擴(kuò)增得到編碼肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS。再將GmGolS基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28上，隨后將該載體導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，對(duì)其進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時(shí)間為3 h、IPTG濃度為0.1 mmol/L的條件下，可獲得大量重組蛋白，相對(duì)分子量約為40 ku。對(duì)表達(dá)GmGolS蛋白的大腸桿菌進(jìn)行抗旱性分析，結(jié)果顯示，GmGolS基因在大腸桿菌中的過(guò)表達(dá)降低了重組菌的生活力，使其對(duì)干旱脅迫更加敏感。

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收稿日期：2019-11-06

基金項(xiàng)目：黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃（編號(hào)：UNPYSCT-2017153）;黑龍江省省屬高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（植物性食品加工技術(shù)特色學(xué)科專(zhuān)項(xiàng)）（編號(hào)：YSTSXK201878）;黑龍江省省屬高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（編號(hào)：135209264）。

作者簡(jiǎn)介：邱 爽（1995—），男，山東濟(jì)寧人，碩士，主要從事大豆分子育種研究。E-mail：qs187143@163.com。

通信作者：翟 瑩，博士，副教授，主要從事大豆分子育種研究。E-mail：fairy39809079@126.com。