呂明月，崔瑩瑩，唐祎依，黨光輝，崔子寅，劉思國*，宋寧寧*

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

結(jié)核病（Tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的嚴重危害人類健康的重要傳染病。全世界約三分之一的人被感染，每年有數(shù)以百萬計的人因結(jié)核病而死亡[1]。MTB 之所以能夠在宿主體內(nèi)長期滯留而不引起任何疾病癥狀，是因為其具有適應(yīng)廣泛生存環(huán)境的能力，例如低氧環(huán)境、樹突狀細胞、休眠和活化的巨噬細胞[2]。因此，解析MTB 調(diào)控適應(yīng)外界環(huán)境和宿主體內(nèi)長久滯留的分子機制具有重要的科學(xué)意義。

一般來說，TetR 家族蛋白是一種轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，它能夠與DNA 結(jié)合，在沒有特定配體的情況下抑制轉(zhuǎn)錄。當(dāng)配體存在時，配體則會與TetR 的C 端結(jié)合引起構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致與靶DNA 的分離[3]。Rv3295 隸屬于TetR 家族蛋白，然而目前受Rv3295 調(diào)控的靶基因及其影響調(diào)控作用的輔助因子尚不清楚。Rv3229c（DesA3）是一種與膜結(jié)合的硬脂酰輔酶A（CoA）去飽和酶，與氧化還原酶Rv3230c 共同合成油酸。油酸是分枝桿菌膜甘油三酯和磷脂的前體[4]。另外，在分枝菌酸合成過程中，油酸可以將雙鍵引入到特定的分枝菌酸結(jié)構(gòu)中[5]。前期已有研究證明，DesA3是MTB 在巨噬細胞內(nèi)存活所需的關(guān)鍵基因，表明油酸在MTB 代謝過程中起重要作用[6]。二線抗結(jié)核藥物硫脲異氧基靶標于DesA3，對耐藥菌株MTB 具有殺滅作用，并已與異煙肼聯(lián)合用于臨床治療[7-8]。

本研究中，rv3229c 是否為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Rv3295新的調(diào)控靶點？且哪些小分子會影響Rv3295 與rv3229c 的結(jié)合？Rv3295 中哪些重要氨基酸殘基參與了與小分子的互作？這幾個重要科學(xué)問題的闡述對于我們深入了解Rv3295 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及后期藥物靶標的篩選奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、載體及實驗動物MTB H37Rv 基因組和pET-22b 載體由本實驗室保存；E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。新西蘭大白兔購自坤達養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑7H9 和LB 液體/固體培養(yǎng)基均購自美國BD 公司；IPTG 購自美國Amresco 公司；BCA 蛋白檢測試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和DNA 膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；M-280 羊抗兔IgG 免疫磁珠購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；甲基綠購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；放線菌素D 購自Alphabio 公司；iPure DNA 提取試劑盒購自Diagenode 公司。

1.3 重組蛋白Rv3295 的表達與純化參照rv3295基因序列（Gene ID:887180）設(shè)計引物SN7f 和SN8r，以MTB H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴增rv3295基因（表1），經(jīng)雙酶切后克隆至pET-22b載體，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-22b-rv3295，經(jīng)酶切與測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞。37 ℃180 r/min培養(yǎng)至OD600nm=0.6時加終濃度1 mmol/L IPTG 30 ℃過夜誘導(dǎo)表達，離心收集菌體。超聲破碎后離心、留上清棄沉淀。利用Ni-NTA親和樹脂進行純化，經(jīng)500 mmol/L咪唑洗脫，然后透析，經(jīng)SDS-PAGE 和western blot 鑒定，以BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

1.4 凝膠遷移試驗（EMSA）在5'端分別用Cy5 標記的引物SN387f 與SN387r 通過PCR 擴增Cy5 標記的DNA 片段rv3229c（表1），然后進行EMSA。EMSA 反應(yīng)體系（20 μL）：40 ng/μL Cy5 標記DNA；2 μL 10×binding buffer；2 μL 25 mmol/L DTT；1 μL 1 mg/mL poly（dI-dC）和不同濃度（0.4 μmol/L、0.8 μmol/L）的Rv3295，37 ℃孵育30 min。8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠在200 V 下電泳3 h～4 h，分離DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使用凝膠成像系統(tǒng)掃描。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers table

1.5 DNA 大溝小溝結(jié)合試驗為確定Rv3295 與rv3229c啟動子主要結(jié)合的區(qū)域，用Cy5標記的rv3229c探針分別與2.5 μmol/L、25 μmol/L、250 μmol/L 的甲基綠（一種主要與大溝結(jié)合的試劑)和2.5 μmol/L、25 μmol/L、250 μmol/L 放線菌素D（一種與小溝結(jié)合的試劑）一起孵育。20 μL 體系中包括100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）；500 mmol/L KCl；10 mmol/L DTT；1 mg/mL poly（dI-dC）和Rv3295，37 ℃孵育30 min。通過EMSA 對其進行分析。

1.6 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）試驗采用ChIP 方法測定Rv3295 在體內(nèi)與DNA 的結(jié)合能力。將純化的Rv3295 蛋白與弗氏不完全佐劑進行體積比為1∶1 混合后對兩只新西蘭大白兔進行皮下注射，每只兔子注射400 μg，每隔14 d 注射一次，注射3 次后進行心臟采血，制備血清，-80 ℃保存，該血清用于后續(xù)的ChIP 試驗。

將MTB H37Rv 在200 mL 7H9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm=0.8），1%甲醛固定10 min，加入125 mmol/L甘氨酸反應(yīng)5 min，終止反應(yīng)。7000 r/min離心10 min 后用3 mL IP 緩沖液重懸沉淀，利用20%振幅，on 3 s，off 5 s的超聲破碎儀在冰上超聲破碎5 min，13000 r/min 離心20 min，轉(zhuǎn)移上清至新的EP 管中，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得100 bp～700 bp 的超聲DNA 片段。利用辛酸-硫酸銨法[9]純化Rv3295 多克隆抗體。用20 μL Rv3295 多克隆抗體與M-280 羊抗兔抗體偶聯(lián)制備包被磁珠。1.5 mL 上清液中，取100 μL 作為對照，其余1.4 mL 與包被磁珠在4 ℃孵育3 h，用離心法收集免疫復(fù)合物，65 ℃孵育過夜，用iPure DNA 提取試劑盒純化樣品，酚氯仿萃取兩次DNA，乙醇沉淀，采用引物SN387f/SN387r（表1）進行PCR。

1.7 同源建模Rv3295 的目標序列從Uniprot（IDP96900）獲得，用BLAST 鑒定模板晶體結(jié)構(gòu)，并從RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB ID∶2 QIB）中下載。同源建模用MOE v2018.01011[10]進行。在pH 值為7，溫度為300 K 的條件下，用LigX 優(yōu)化蛋白質(zhì)的質(zhì)子化狀態(tài)和氫的取向。首先，對應(yīng)目標序列與模板序列，建立了10 個獨立的中間模型。這些不同的同源模型是通過對不同的循環(huán)候選體和側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)體的置換選擇得到的，最后選擇基于GB/VI 評分函數(shù)得分最高的中間模型作為最終模型，然后利用AMBER 10：EHT 力場進行進一步能量優(yōu)化。

1.8 分子對接用ChemBioDraw 2014 繪制了6 個小分子（VB1、VB3、VB6、VC、Fe3+和Zn2+）的二維結(jié)構(gòu)，并通過能量優(yōu)化得到三維結(jié)構(gòu)。用MOE-Dock 方法研究分子與蛋白質(zhì)之間潛在的分子結(jié)合模型。對接前，選擇AMBER 10：EHT 力場和R-field 隱式溶劑模型。使用MOE 中的Site Finder 模塊識別綁定口袋。附近的殘基包括Ala 22、Phe 25、Gly 26、Phe 60、Val 63、Val 64、Glu 67、Ala 68、Tyr 72、Ala 98、Gln 102、Glu 105、Ala 106 和Leu 121。對接流程遵循“induced fit”法則，結(jié)合口袋的側(cè)鏈可以根據(jù)配體構(gòu)象調(diào)整，并受其位置的限制，用于約束側(cè)鏈轉(zhuǎn)動的權(quán)重為10。對每個配體先用London dG 評分對所有對接位置進行排序，將前20 個構(gòu)象進行力場細化，通過GBVI/WSA dG 再次評價。結(jié)合自由能最低的構(gòu)象為最佳（可能）結(jié)合模式。利用PyMOL（www.pymol.org）生成了分子圖像。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白Rv3295 的純化及鑒定將誘導(dǎo)表達的重組蛋白Rv3295 純化后經(jīng)SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示存在一條26 ku 的條帶（圖1），條帶大小正確，可進行后續(xù)EMSA 試驗。

圖1 重組蛋白Rv3295 純化鑒定結(jié)果Fig.1 Protein purification of Rv3295

2.2 Rv3295 與rv3229c啟動子區(qū)域在體外特異性結(jié)合根據(jù)細菌單雜交數(shù)據(jù)，預(yù)測rv3229c 可能是Rv3295 的靶標[11]。為確定Rv3295 與rv3229c 啟動子區(qū)域是否相互作用，用Rv3295 和Cy5 標記的rv3229c啟動子DNA 進行EMSA（圖2A），結(jié)果顯示，隨著Rv3295 濃度的增加，可以明顯觀察到滯后條帶的出現(xiàn)。為了進一步確認Rv3295 與rv3229c 結(jié)合的特異性，進行了競爭試驗，用非標記冷探針rv3229c 啟動子DNA 與Cy5 標記的rv3229c 啟動子DNA 進行競爭（圖2B），結(jié)果顯示，冷探針rv3229c 啟動子DNA 可競爭性地抑制Rv3295 與Cy5 標記的rv3229c 啟動子DNA 的結(jié)合，表明Rv3295 在體外與rv3229c 啟動子DNA 的結(jié)合是特異性結(jié)合。

2.3 ChIP 試驗結(jié)果利用ChIP 試驗檢測Rv3295 在體內(nèi)與啟動子rv3229c 結(jié)合情況，結(jié)果顯示，從抗-Rv3295 多克隆抗體所提取的免疫復(fù)合物中可以擴增出目標DNA 片段，而免疫前的血清對照組未能擴增rv3229c 啟動子區(qū)域（圖2C），表明Rv3295 與rv3229c 啟動子區(qū)域在體內(nèi)結(jié)合，rv3229c 是MTB Rv3295 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶點。

圖2 Rv3295 與rv3229c 啟動子在體內(nèi)外相互作用Fig.2 Interactions between Rv3295 and rv3229c promoter in vitro and in vivo

2.4 Rv3295 與靶DNA 大溝結(jié)合試驗為探索Rv3295 是與rv3229c 的大溝還是小溝作用，本研究通過增加甲基綠和放線菌素D 的濃度后利用EMSA 進行分析（圖3），結(jié)果顯示，隨著甲基綠濃度的增加，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成受到抑制，出現(xiàn)了更多的非結(jié)合DNA，相反，增加放線菌素D 濃度對DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物無影響。表明Rv3295 與DNA 的大溝相互作用，同時該結(jié)合試驗為了解Rv3295 蛋白與DNA互作的結(jié)構(gòu)模式及調(diào)控作用做了初步的預(yù)測。

圖3 Rv3295 與DNA 大溝結(jié)合試驗Fig.3 Rv3295 binds to the major groove of DNA

2.5 影響Rv3295 與DNA 互作的小分子及金屬離子的篩選轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白往往通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄來感知小分子并適應(yīng)環(huán)境變化。本研究利用EMSA 從一系列氨基酸、維生素和金屬離子中篩選影響Rv3295與rv3229c 啟動子結(jié)合的小分子（圖4）。結(jié)果顯示，不同濃度的VB1、VB3、VB6、VC、Fe3+和Zn2+抑制了Rv3295 與rv3229c DNA 片段的結(jié)合。相反，所有檢測的氨基酸和一些金屬離子（Pb2+、Cd2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Mn2+、Cr3+）、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、四環(huán)素、c-di-GMP、c-di-AMP 不影響DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成（圖5）。該試驗結(jié)果表明VB1、VB3、VB6、VC、Fe3+和Zn2+對Rv3295 與rv3229c DNA 片段的結(jié)合有抑制作用。

圖4 EMSA 檢測維生素和金屬離子對Rv3295 與rv3229c 結(jié)合的影響Fig.4 Effect of vitamins and metal ions on Rv3295 binding to the rv3229c tested by EMSA

圖5 氨基酸、金屬離子和其它小分子對Rv3295 與rv3229c 啟動子結(jié)合的影響Fig.5 Effect of amino acids,metal ions and other cofactors on Rv3295 binding to the rv3229c promoter tested by EMSA

2.6 Rv3295 的同源建模對Rv3295 進行同源建模， Rv3295 的Ramachandran 圖顯示，99%的殘基位于合理區(qū)域（圖6A、6B），表明模型的三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建合理。對Rv3295 模型的結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示，Rv3295 蛋白由11 個螺旋組成，殘基（1～50）形成1～3 螺旋，殘基（54～218）形成4～11 螺旋。Rv3295結(jié)構(gòu)與模型結(jié)構(gòu)基本一致。三維結(jié)構(gòu)重疊的平均RMSD 值為0.78A（圖6C、6D 和圖7）。

圖7 Rv3295 的二維結(jié)構(gòu)Fig.7 The 2D structure of Rv3295

2.7 Rv3295 的分子對接為了研究6 種小分子（VB1、VB3、VB6、VC、Fe3+、Zn2+）與Rv3295 之間潛在的分子結(jié)合模式，本研究進行了分子對接，由GBVI/WSA dG 評分估計的結(jié)合自由能表示蛋白與小分子的結(jié)合能力，較低的結(jié)合分數(shù)表示較高的結(jié)合親和力。結(jié)果顯示，VB1、VB3、VB6和VC主要形成氫鍵，F(xiàn)e3+和Zn2+主要形成鹽橋。Val 64 和Leu 121 與VB1相互作用（圖6E）；Glu 67 與VB3相互作用（圖6F）；Glu 105 與VB6相互作用（圖6G）；Glu 105 與VC相互作用（圖6H）；Glu 67、Gln 102 和Glu 105 與Fe3+相互作用（圖6I）；Glu 67、Gln 72 和Ala 98 與Zn2+（圖6J）相互作用（表2）。表明Glu 67 和Glu 105 氨基酸殘基在Rv3295 與小分子及金屬離子的相互作用中起重要作用。

圖6 Rv3295 的同源建模和分子對接Fig.6 Homology modeling and Molecular Docking of Rv3295

表2 Rv3295 與小分子對接打分情況Table 2 The docking score between Rv3295 and ligands

3 討 論

TetR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族廣泛分布于細菌中，主要參與抗生素耐藥、調(diào)控編碼小分子的基因、群體感應(yīng)和原核生理學(xué)等生理功能[12]。Rv3295 隸屬于TetR 家族蛋白，但是其調(diào)控功能及影響調(diào)控的小分子尚未見相關(guān)報道。MTB Rv3229c 編碼DesA3，為MTB 3 種需氧硬脂酰脫飽和酶（DesA1、DesA2 和DesA3）之一[13]，其過表達與低水平異氧抗性（ISO）有關(guān)，ISO 是類似于異煙肼（INH）和乙硫酰胺（ETH）的硫脲衍生物，可抑制分枝菌酸的合成，并已用于結(jié)核病的臨床治療[8]。

MTB 通過感知某些小分子，利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，啟動自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)進而適應(yīng)環(huán)境變化。已知的TFR（TetR family of regulators）配體種類多樣，包括膽汁酸、抗生素、蛋白質(zhì)、脂肪酸及其衍生物、細胞信號分子、碳源和金屬離子[12]。通過EMSA 篩選影響Rv3295 與DNA 互作的小分子及金屬離子的試驗中發(fā)現(xiàn)VB1、VB3、VB6、VC、Fe3+、Zn2+影響Rv3295 與DNA 的結(jié)合。這是關(guān)于維生素影響TetR 家族蛋白與靶基因DNA 結(jié)合的首次報告，表明TetR 家族蛋白具有廣泛的小分子適應(yīng)性。除了Rv3295 外，維生素（VC）也對隸屬于Lrp 家族蛋白的Rv3291c（LrpA）轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與其目標基因的結(jié)合有抑制作用[14]，鑒于某些維生素具有抗菌特性，并參與MTB 的關(guān)鍵生物合成途徑。因此，維生素作為調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的小分子具有潛在的重要的研究和臨床應(yīng)用價值。

TetR 家族調(diào)控因子（TFRs）具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)，包含兩個結(jié)構(gòu)域：與DNA 結(jié)合的N-末端和與配體結(jié)合的C-末端[15]。迄今為止，幾個TFR-小分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)已被解析[12]，這對于了解小分子存在的條件下TFR 的調(diào)控機制具有重要意義。有研究表明甲基綠、放線菌素D 分別與DNA 的大溝或小溝相互作用[16]。通常小溝結(jié)合蛋白以高親和力結(jié)合DNA，表現(xiàn)出完全不同的整體褶皺，并以不同的方式重建DNA 構(gòu)象，并與疏水基相互作用進而與其他蛋白結(jié)合，從而有效地充當(dāng)DNA 伴侶。一般而言，TFRs 的保守結(jié)構(gòu)中包含9 個α螺旋。螺旋1～3 形成DNA 結(jié)合區(qū)，具有顯著的序列同源性，螺旋4～9 形成了不同的配體結(jié)合域，使得這些配體可與這個家族的不同調(diào)控基因結(jié)合[17]。然而，空腸彎曲菌CemR 卻缺乏通過與DNA 大溝相互作用且與靶DNA 特異性結(jié)合所需的螺旋3[17]?；プ鞯慕Y(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，Rv3295C-末端與小分子（VB1、VB3、VB6、VC）及金屬離子（Fe3+、Zn2+）存在相互作用，這與大多數(shù)已解析的TetR 家族蛋白結(jié)構(gòu)特點相符合，由于位于C 端結(jié)構(gòu)域的Glu 67 和Glu 105 參與了與大多數(shù)被測配體的結(jié)合，因此猜測這兩個殘基可能在與輔助因子的相互作用中起重要作用，但仍需通過構(gòu)建點突變蛋白進行后續(xù)驗證。另外，大多數(shù)TFRs 主要利用特定小分子與其C 端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。雖然目前還尚未有小分子影響Rv3295 調(diào)控的具體機制的相關(guān)報道，但其分子對接結(jié)果部分說明了小分子有可能也是通過C 端結(jié)構(gòu)改變與Rv3295 的結(jié)合親和力，從而調(diào)節(jié)基因的表達。

通過EMSA 與ChIP 聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)Rv3295 在體外與體內(nèi)均與desA3 啟動子結(jié)合，這表明Rv3295 可以直接調(diào)控desA3 的表達，且參與油酸的合成調(diào)控，暗示該蛋白在MTB 的致病性中起到重要的調(diào)控作用。該研究是對關(guān)于Rv3295 調(diào)控desA3 基因表達的首次相關(guān)報告。綜上所述，本研究對Rv3295 的調(diào)控功能研究奠定了理論基礎(chǔ)，并對后期藥物靶標的篩選做了一定的鋪墊工作。