吳駿晨，李 丁，喬緒穩(wěn)，張元鵬，陳 瑾，鄭其升*，牛家強(qiáng)，侯繼波

（1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2. 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014）

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前基因工程中最常使用的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，因其生長速度快、易于遺傳操作和高水平的重組蛋白合成率而成為多種重組蛋白表達(dá)的理想宿主之一。但復(fù)雜的LPS 純化過程是利用該表達(dá)系統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)目的蛋白，特別是獸用疫苗蛋白抗原的核心瓶頸之一[1]。

內(nèi)毒素又名脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），一般由類脂A、核心寡糖和O-抗原構(gòu)成。其中類脂A 與大腸桿菌毒力相關(guān)。通過LPS 類脂A 的介導(dǎo)作用，致病菌可以被宿主表面的Toll-like 受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）識別，引起細(xì)胞反應(yīng)并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，從而引起機(jī)體發(fā)熱、寒戰(zhàn)等癥狀。雖然，細(xì)菌LPS 一直以來都被認(rèn)為是一種潛在的佐劑，但其毒性作用限制了其應(yīng)用于人體[2]。Ribi等人研制了無毒力的單磷酰脂質(zhì)A（MPLA），MPLA、鋁佐劑和抗原組成的疫苗是目前批準(zhǔn)的乙型肝炎疫苗和乳頭瘤疫苗的主要成分，且安全有效[3-4]。LPS和MPLA 均能夠特異性激活TLR4，但MPLA 僅通過β-干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（Toll-interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β，TRIF）進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而LPS 則同時通過TRIF 和髓樣分化因子88（MyD88）途徑傳導(dǎo)，而后者往往會導(dǎo)致較高水平的炎癥因子尤其是TNF-α的表達(dá)[5]。

類脂A 的合成途徑相對保守，在其轉(zhuǎn)運到外膜外側(cè)的過程中其結(jié)構(gòu)會發(fā)生不同的修飾作用以適應(yīng)不同的外界環(huán)境。類脂A 的結(jié)構(gòu)修飾在細(xì)菌體內(nèi)受到非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控且與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)，但卻不影響細(xì)菌的增殖[2,6]?；诖?，本研究利用Red重組系統(tǒng)對大腸桿菌DH10B-2B 進(jìn)行基因編輯，敲除與LPS合成相關(guān)的kdsD、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、eptA等基因，以降低大腸桿菌LPS 的毒力[7-8]，并在該大腸桿菌中表達(dá)弗朗西斯菌的LpxE 磷酸酶，后者可去除類脂A 的1-磷酸基團(tuán)，從而進(jìn)一步降低大腸桿菌LPS 的毒性作用[9]。本研究經(jīng)鱟試劑、小鼠感染試驗檢測了改造大腸桿菌LPS 的毒力，同時檢測了感染小鼠的細(xì)胞因子，旨在構(gòu)建既可以用作低LPS 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，也可以用于低毒力LPS 提取的大腸桿菌，為相關(guān)免疫增強(qiáng)劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料菌種DH10B-2B 及質(zhì)粒R6Kbox（內(nèi)有l(wèi)ox71-KanR-lox66 打靶元件）、pKD46（溫敏質(zhì)粒）、pCP-Cre（溫敏質(zhì)粒）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)崔中利老師惠贈；lpxE 基因由南京金斯瑞公司合成后亞克隆至R6K-box 中構(gòu)建重組質(zhì)粒lpxE-R6k-box。

高保真酶（TransStart FastPfuFly DNA Polymerase）和6×DNA Loading Buffer 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×Taq Master Mix（Dye Plus）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；薄型瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（離心柱型）和質(zhì)粒小量制備試劑盒（離心柱型）購自上海捷瑞生物工程有限公司；溶菌酶、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（5 000 bp）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；鱟試劑購自湛江安度斯生物有限公司，IL-6及TNF-a ELISA 試劑盒購自南京奧青生物科技有限公司。BALB/c小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 引物設(shè)計與合成本實驗所用引物見表1，以制備敲除大腸桿菌DH10B-2B 中kdsD 基因的線性雙鏈DNA 打靶元件的引物為例，根據(jù)GenBank 中大腸桿菌K-12 的kdsD 基因序列（947734），在其上下游約100 bp 處尋找約50 bp 的序列，并于上游50 bp 序列的5'端加上20 bp lox71 的序列，下游50 bp 的3'端加 上20 bp lox66 的 序 列（lox71 及l(fā)ox66 為 質(zhì) 粒R6K-box 中打靶元件的部分基因序列），最終分別合成70 bp 的引物對kdsD-F/kdsD-R。在kdsD 基因前后約200 bp 處分別截取約25 bp 的序列kdsD-YZ-F/kdsD-YZ-R 作為鑒定kdsD 基因敲除的引物。此外，從質(zhì)粒R6K-box中KanR內(nèi)部截取25 bp片段的kan-YZF 用于kdsD 打靶元件插入DH10B-2B 株基因組后的鑒定。其他基因敲除引物和插入基因的打靶元件設(shè)計同上。全部引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 本實驗用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.3kdsD線性雙鏈DNA 打靶元件的制備以R6K-box 質(zhì)粒為模板，利用kdsD-F/kdsD-R 引物對擴(kuò)增kdsD 的打靶元件kdsD-Lox。PCR 產(chǎn)物純化回收后由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。其他基因的打靶元件均以R6K-box 質(zhì)粒為模板同理構(gòu)建。

1.4 缺失kdsD基因菌株的篩選與鑒定采用CaCl2法將編碼Red 重組系統(tǒng)的pKD46 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10B-2B，利用含有Amp+（50 μg/mL）的LB 固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選。將經(jīng)過篩選的轉(zhuǎn)化子接種于200 mL終濃度含50 μg/mL Amp+和20 mmol/L L-阿拉伯糖的LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm=0.4～0.6，采用電擊法轉(zhuǎn)化打靶元件kdsD-Lox，電轉(zhuǎn)菌液涂布于含有Kan+（30 μg/mL）的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)化子利用kan-YZ-F/kdsD-YZ-R 引物對進(jìn)行PCR 鑒定，正確的轉(zhuǎn)化子命名為DH10B-2B（ΔkdsD∷kan）。

1.5lox位點重組大腸桿菌的獲得與鑒定采用CaCl2法將pCP-Cre 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10B-2B（ΔkdsD∷kan）中，利用含Chl+（20 μg/mL）的LB 平板篩選。將篩選的轉(zhuǎn)化子接種到4 mL 含Chl+和IPTG 的LB 液體培養(yǎng)管中，培養(yǎng)約10 h，再于43 ℃過夜培養(yǎng)后經(jīng)LB 平板劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取單菌落依次轉(zhuǎn)接于含Kan+（30 μg/mL）、Amp+（50 μg/mL）、Chl+（20 μg/mL）和無抗生素的LB 平板上37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取3 種抗性平板都不生長而只在無抗LB 平板上生長的轉(zhuǎn)化子，提取其全基因組后，采用kdsD-YZ-F/kdsD-YZ-R 引物對進(jìn)行PCR 鑒定。正確的轉(zhuǎn)化子命名為DH10B-2B（ΔkdsD）。

1.6 其他與LPS 合成相關(guān)基因的敲除基因lpxL、lpxM、pagP、lpxP、eptA 的敲除方法同上述kdsD 基因的敲除方法，所需引物見表1。全部基因敲除后的大腸桿菌經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。敲除所有6 個基因的菌株命名為DH10B-2B-Δ6。

1.7lpxE基因的重組以質(zhì)粒lpxE-R6k-box 為模板，lpxE-F/lpxE-R 為引物對制備打靶元件，重組方法同1.4。得到的轉(zhuǎn)化子（lpxE-Lox 重組至DH10B-2B-Δ6 的OmpT 基因處）以O(shè)mpT-YZ-F/OmpT-YZ-R引物對做PCR 鑒定，正確的轉(zhuǎn)化子命名為DH10B-2B-Δ6-lpxE。

1.8 改造后的大腸桿菌LPS 含量的測定將DH10B 接 種 于200 mL LB 培 養(yǎng) 基 中，DH10B-2B-Δ 6-lpxE 接種于200 mL Kan+抗性LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后經(jīng)菌落計數(shù)。兩種菌液分別經(jīng)PBS 洗滌3 次，調(diào)整菌落數(shù)量至1.6×1010cfu/mL，將其10 被倍比稀釋（108cfu/mL～105cfu/mL）后分別經(jīng)20 mg/mL 溶菌酶處理，再經(jīng)超聲波破碎，離心后收集上清。按照鱟試劑說明書檢測兩種菌粗提物的LPS。

1.9 改造后的大腸桿菌對小鼠的毒力試驗將45只BALB/c小鼠分為9組，5只/組，其中4組小鼠分別注射濃度為1.6×1010cfu/mL～1.6×107cfu/mL 的DH10B超聲裂解物300 μL，另外4 組分別注射濃度為1.6×1010cfu/mL～1.6×107cfu/mL 的DH10B-2B-Δ6-lpxE 超聲裂解物300 μL，最后一組注射等量無菌PBS 作為對照組。觀察各組小鼠24 h 內(nèi)的臨床癥狀。

1.10 小鼠脾臟細(xì)胞因子的檢測上述細(xì)菌裂解物注射小鼠24 h 后迫殺采集其脾臟樣品于2 mL EP 管中，加入生理鹽水，置冰上研磨均勻，離心15 min后收獲上清，采用ELISA 試劑盒分別檢測IL-6、TNF-α的含量。

2 結(jié) 果

2.1 線性雙鏈DNA 打靶元件的制備結(jié)果以質(zhì)粒R6k-Box 為模板，kdsD-F/kdsD-R 為引物，對制備的打靶元件進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示得到約為1 000 bp 的目的條帶，與預(yù)期一致；其余打靶元件照此制備（圖1）。測序結(jié)果顯示打靶元件均與模板一致。表明各打靶元件正確制備。

圖1 打靶元件的制備Fig.1 Preparation of targeting elements

2.2 缺失kdsD基因菌株的篩選與鑒定結(jié)果將打靶元件kdsD-Lox 電轉(zhuǎn)化至已轉(zhuǎn)化了pKD46 質(zhì)粒的DH10B-2B 菌中，涂布于Kan+平板篩選出重組菌，利用kan-YZ-F/kdsD-YZ-R 引物對其經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增出約為1 200 bp 的目的條帶，與預(yù)期一致（圖2），經(jīng)測序鑒定序列正確。表明打靶元件重組至DH10B-2B 的基因組中，得到重組菌DH10B-2B（ΔkdsD∷kan）。

圖2 重組菌株DH10B-2B（ΔkdsD∷kan）的PCR 鑒定結(jié)果Fig.2 The PCR identification of the recombinant strains DH10B-2B(ΔΔkdsD∷kan)

2.3lox位點重組菌株的獲得與鑒定結(jié)果將pCP-Cre 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10B-2B（ΔkdsD∷kan） 中，在IPTG 誘導(dǎo)下，pCP-Cre 質(zhì)?？杀磉_(dá)Cre 重組酶誘導(dǎo)lox71 和lox66 位點重組并失去其中的KanR，再通過43 ℃培養(yǎng)使溫敏質(zhì)粒pKD46 和pCP-Cre 丟失，獲得不含任何抗性基因的lox 位點重組菌，經(jīng)PCR 鑒定僅能在無抗LB 上生長的菌落。結(jié)果顯示，重組菌株在約500 bp 出現(xiàn)目的條帶，而DH10B-2B 經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到約1500 bp 左右的條帶（圖3），表明kdsD 基因已經(jīng)敲除。得到的重組菌株命名為DH10B-2B（ΔkdsD）。

圖3 重組菌株DH10B-2B（ΔkdsD）的PCR 鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of the recombinant strains DH10B-2B(ΔkdsD)

2.4 其它LPS 合成相關(guān)基因的敲除結(jié)果其它基因的敲除同kdsD 基因的敲除方法，各基因全部敲除后的菌株以各自的引物進(jìn)行PCR 鑒定。結(jié)果顯示，PCR 擴(kuò)增得到的條帶均位于500 bp 左右，而野生型大腸桿菌DH10B-2B 的PCR 擴(kuò)增則得到1 000 bp～2 000 bp的目的條帶（圖4）。表明大腸桿菌DH10B-2B中6 個LPS 合成相關(guān)基因均已經(jīng)被正確敲除，最終得到重組菌DH10B-2B-Δ6。

圖4 重組菌株DH10B-2B-Δ6 的PCR 鑒定結(jié)果Fig.4 PCR identification of the recombinant strains DH10B-2B-Δ6

2.5lpxE基因重組的鑒定結(jié)果以1.4 的方法將lpxE-Lox 重組至DH10B-2B-Δ6 的OmpT 基因處，采用引物OmpT-YZ-F/OmpT-YZ-R 對獲得的重組菌進(jìn)行PCR 鑒定。結(jié)果顯示，重組菌DH10B-2B-Δ 6-lpxE 擴(kuò)增得到的片段約為2 200 bp，而野生型DH10B-2B 經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到的條帶約1 200 bp（圖5）。表明lpxE 基因已經(jīng)正確插入到重組菌株DH10B-2B-Δ6 的OmpT 基因處。

圖5 重組菌株DH10B-2B-Δ6-lpxE 的PCR 鑒定結(jié)果Fig.5 PCR identification of the recombinant strains DH10B-2B-Δ6-lpxE

2.6 改造后E. coliLPS 的檢測結(jié)果采用鱟試劑檢測改造后的DH10B-2B-Δ6-lpxE 粗提物L(fēng)PS。由于檢測菌的濃度較大，無法測算LPS 具體含量，故僅展示LPS 的陰陽性結(jié)果。結(jié)果顯示，106cfu/mL 野生型DH10B-2B 裂解液LPS 檢測結(jié)果為陽性， 而106cfu/mL DH10B-2B-Δ6-lpxE 裂解液LPS 結(jié)果為陰性，108cfu/mL DH10B-2B-Δ6-lpxE 裂解液檢測結(jié)果為陽性（表2）。表明，相較于野生型DH10B-2B，DH10B-2B-Δ6-lpxE 產(chǎn)生LPS 的能力明顯減弱。

表2 鱟試劑檢測結(jié)果Table 2 The results of tachypleus amebocyte lysate test

2.7 改造后的大腸桿菌對小鼠的毒力試驗結(jié)果小鼠注射1.6×1010～1.6×107cfu/mL 改造前后的大腸桿菌裂解液均未出現(xiàn)死亡，但注射1.6×1010cfu/mL 野生型大腸桿菌裂解液的小鼠（5/5）在24 h 內(nèi)相繼出現(xiàn)腹瀉、被毛蓬亂、精神沉郁、運動能力和應(yīng)激反應(yīng)減弱，眼角有膿性分泌物；而注射相同劑量DH10B-2B-Δ6-lpxE 的小鼠（2/5）在24 h 內(nèi)僅出現(xiàn)軟便、精神略差、被毛松散的癥狀。注射1.6×109cfu/mL 野生型大腸桿菌裂解液的小鼠（4/5）在24 h 內(nèi)相繼出現(xiàn)腹瀉、被毛蓬亂、精神萎靡的癥狀，而注射相同劑量DH10B-2B-Δ6-lpxE 裂解液的小鼠在24 h 內(nèi)未出現(xiàn)明顯的癥狀。表明改造后的大腸桿菌產(chǎn)生的LPS 對小鼠的毒力明顯降低。

2.8 小鼠脾臟細(xì)胞因子的檢測結(jié)果利用ELISA方法檢測各組小鼠脾臟中的IL-6 與TNF-α炎性細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示，DH10B-2B-Δ6-lpxE 裂解物注射小鼠后其脾臟產(chǎn)生的IL-6 和TNF-α的含量均隨著注射劑量的增加而增加，雖然均高于注射PBS 的對照組小鼠，但相較于注射同等劑量野生型DH10B-2B 裂解液的小鼠，其分泌細(xì)胞因子的能力明顯降低（p＜0.05；p＜0.01）（圖6）。結(jié)果表明相較于野生型DH10B-2B，DH10B-2B-Δ6-lpxE 的LPS 引起的炎癥反應(yīng)更加輕微，其毒力明顯減弱，具有用于疫苗佐劑的潛力。

圖6 各組大腸桿菌裂解物感染小鼠后的細(xì)胞因子檢測結(jié)果Fig.6 Cytokine detection results of mice infected with E.coli lysates in each group

3 討 論

大腸桿菌是一種常見的革蘭氏陰性細(xì)菌，因其生長快、培養(yǎng)廉價、基因操作簡單快捷、易于規(guī)?；l(fā)酵的特點被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的生產(chǎn)[10]。然而大腸桿菌外膜中大量存在的LPS 作為一種強(qiáng)力免疫刺激分子，進(jìn)入動物體內(nèi)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種生物活性因子，從而發(fā)生感染性休克[11]。因此通過大腸桿菌生產(chǎn)的重組蛋白必須將LPS 去除后才能投入使用，這大大增加了開發(fā)重組蛋白產(chǎn)品的工序和成本。

為構(gòu)建一株低毒力的大腸桿菌用作重組蛋白表達(dá)體系或用于提取低毒力的LPS 。本研究通過Red和Cre-Lox 敲除系統(tǒng)相結(jié)合的方法，敲除大腸桿菌DH10B-2B 株中與LPS 合成相關(guān)的基因（kdsD、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、eptA），并在其OmpT 基因處插入弗朗西斯菌的磷酸酶基因lpxE，得到LPS 缺陷型大腸桿菌DH10B-2B-Δ6-lpxE。kdsD 基因調(diào)控合成LPS 中3-去氧-D-甘露-2-辛酮糖酸（Kdo）的關(guān)鍵酶的合成；LpxL、LpxM 分別在LPS 遠(yuǎn)端的氨基葡萄糖中添加一個次級月桂酰殘基和一個豆蔻醇?xì)埢?；PagP 將棕櫚酸酯從甘油磷脂轉(zhuǎn)移到類脂A 的β-2 位置，形成七?；Y(jié)構(gòu)；LpxP 與LpxL 具有很高的相似度，在低溫條件下以棕櫚油酸取代月桂酸轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)A2'位置；EptA 則可在細(xì)菌內(nèi)膜外表面將磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移至類脂A[12-13]。研究表明，敲除這些基因后可降低LPS 對機(jī)體的免疫刺激作用，降低細(xì)菌感染帶來的風(fēng)險[14-16]。通過將弗朗西斯菌的lpxE 基因整合到大腸桿菌的基因組中使其表達(dá)LpxE酶，可以去除LPS 中的類脂A1-磷酸基團(tuán)，使大腸桿菌表達(dá)出僅含一個磷酸基團(tuán)的類脂A，即單磷酸脂質(zhì)A（MPLA）[17]。MPLA 是一種僅含一個磷酸基的脂質(zhì)A 衍生物，在保留了許多免疫調(diào)節(jié)特性的同時其毒力比野生型脂質(zhì)A 小得多[18-19]。

鱟試劑檢測結(jié)果表明DH10B-2B-Δ6-lpxE 裂解液中LPS 的含量要遠(yuǎn)低于野生型細(xì)菌。與野生型細(xì)菌相比，感染相同濃度DH10B-2B-Δ6-lpxE 裂解液的小鼠癥狀更輕微，恢復(fù)的更快。并且ELISA 結(jié)果顯示改造后的細(xì)菌刺激小鼠產(chǎn)生IL-6 及TNF-a 的水平明顯減弱。而通常游離的LPS 進(jìn)入機(jī)體后可以激活TLR4，刺激TRIF 和MyD88 信號通路，產(chǎn)生較高水平的炎癥因子尤其是TNF-α及IL-6 等[11]。以上結(jié)果 均 表 明DH10B-2B-Δ6-lpxE 的LPS 毒 力 相 較 于DH10B-2B 明顯減弱。

本研究通過敲除與大腸桿菌LPS 合成相關(guān)的酶基因，并插入lpxE 基因去除了LPS 類脂A 中的A1-磷酸基團(tuán)，構(gòu)建了LPS 缺陷型重組菌DH10B-2BΔ6-lpxE，該菌產(chǎn)生的LPS 毒力顯著降低，為其以后作為低毒力大腸桿菌表達(dá)體系及用于提取減毒LPS作為疫苗免疫增強(qiáng)劑研究奠定了基礎(chǔ)。