邢波建，景一明，王權(quán)锜，劉玉芬

（哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025）

Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）屬于I 型跨膜糖蛋白，是動(dòng)物體內(nèi)一類重要的模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRPs），通過(guò)識(shí)別保守的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，從而清除病原微生物及其代謝產(chǎn)物，發(fā)揮重要的免疫防御作用[1]。近年來(lái)相關(guān)研究顯示，當(dāng)病原體感染機(jī)體時(shí)，TLRs分子被激活，信號(hào)可以通過(guò)相關(guān)分子介導(dǎo)，進(jìn)而激發(fā)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生干擾素（Interferon，IFN）、白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）和腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）等效應(yīng)分子，有效抵御各種病原體的入侵[2-5]。目前，已經(jīng)確認(rèn)禽類有10 種TLRs，其中TLR15 為禽類特有，有研究顯示，清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞在受到雞白痢沙門菌感染后，血液中TLR15 的表達(dá)量會(huì)明顯升高[6]。對(duì)健康馬崗鵝不同組織TLR15 轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)顯示，TLR15 在18 種組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異[7]。推測(cè)TLR15 在家禽感染中具有重要的作用。

細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭陰性菌胞壁的主要成分，可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）或核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)多種炎性因子的表達(dá)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，所以常用于炎癥模型的誘導(dǎo)[8-9]。本研究擬對(duì)LPS 誘導(dǎo)下，東北白鵝TLR15 及相關(guān)免疫因子的水平進(jìn)行分析，為TLR15 的免疫功能研究奠定基礎(chǔ)，也為鵝抗病育種研究提供相關(guān)材料。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料2 日齡健康東北白鵝購(gòu)自哈爾濱呼蘭區(qū)某養(yǎng)殖孵化場(chǎng)，移至實(shí)驗(yàn)室在相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。RNA Extraction Reagent、HiScript II Q RT Super Mix for qPCR（+gDNA wiper）和ChamQ SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司；LPS購(gòu)自Sigma 公司；羊抗兔IgG-HRP 和山羊血清封閉液購(gòu)自索萊寶（Solarbio）科技有限公司；兔抗鵝TLR15 多抗由普?。ㄎ錆h）公司制備合成。其他試劑均為分析純。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)方法將雛鵝隨機(jī)分為對(duì)照組和LPS誘導(dǎo)組，采用頸背部注射方式，LPS誘導(dǎo)組按1 mg/kg劑量注射LPS 溶液（Sigma-L2880，血清型，055∶B5；用生理鹽水稀釋成1 mg/mL），對(duì)照組注射等量的生理鹽水，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狀態(tài)。參照文獻(xiàn)[10]方法，24 h 后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、胸腺和骨髓組織，一部分樣品用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，另一部分于-80 ℃冷凍保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 上鵝TLR15 基因序列（JQ014619.1），IL 基因（IL-1β：AY426338.1；IL-6：JF437643.1）和IFN 基 因（IFN-α：JX464224.1；IFN-γ：KP325480.1、AY524421.1），應(yīng) 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，選取鵝GAPDH 基因[11]作為內(nèi)參基因（XM013199522.1、AY436595.1）（表1）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Lists of primers

1.4 東北白鵝不同組織TLR15 的檢測(cè)依照RNA Extraction Reagent 操作程序，對(duì)東北白鵝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、胸腺和骨髓組織充分研磨，提取各組織中的總RNA，利用HiScript II QRT Super Mix for qPCR（+gDNA wiper）進(jìn)行總RNA的純化和反轉(zhuǎn)錄后，以此為模板，采用引物T-15 F/T-15 R，按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix 說(shuō)明分別檢測(cè)各組織TLR15 基因轉(zhuǎn)錄情況。設(shè)定反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃10 s、60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；融解反應(yīng)為60 ℃～95 ℃。輸出每個(gè)孔的CT 值，以2-ΔΔCT法計(jì)算其轉(zhuǎn)錄水平，采用IBM SPSS 19.0 單因素方差分析顯著性。

1.5 東北白鵝不同組織TLR15 的免疫組織化學(xué)檢測(cè)參照文獻(xiàn)[12]的方法，對(duì)無(wú)菌采集的東北白鵝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，使用Image J軟件對(duì)免疫組織化學(xué)染色部分進(jìn)行灰度分析，計(jì)算相對(duì)染色面積。

1.6 東北白鵝不同組織相關(guān)免疫因子的檢測(cè)參照1.4 中方法，采用相應(yīng)引物，利用qPCR 分別檢測(cè)LPS 誘導(dǎo)下各組織中IL-1β，IL-6，IFN-α，IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄情況。

2 結(jié) 果

2.1 東北白鵝不同組織TLR15 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)對(duì)東北白鵝不同組織進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)組TLR15 基因轉(zhuǎn)錄水平均高于對(duì)照組，其中法氏囊、脾臟、胸腺、肝臟和骨髓組織與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)錄水平差異極顯著（p＜0.01），心臟組織與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)錄水平差異顯著（p＜0.05），但在肺臟和腎臟組織中與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著（p＞0.05）（圖1）。表明東北白鵝在感染后，可以顯著上調(diào)部分組織中TLR15 的轉(zhuǎn)錄水平。

圖1 TLR15 在東北白鵝不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.1 Transcription level of TLR15 in different tissues of northeast white geese

2.2 東北白鵝不同組織TLR15 免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)東北白鵝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟以及法氏囊等6 個(gè)組織進(jìn)行TLR15的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。結(jié)果顯示，在LPS 誘導(dǎo)組中陽(yáng)性染色細(xì)胞呈深黃色，少數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞呈淺黃色，染色主要呈現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞外無(wú)特異性染色的出現(xiàn)，而對(duì)照組陽(yáng)性染色極少；法氏囊組織染色最深，脾臟和肝臟次之，心臟、肺臟和腎臟染色較淺（圖2）。對(duì)所得圖片使用Image J 軟件，進(jìn)行表達(dá)量灰度分析，結(jié)果顯示法氏囊、脾臟和肝臟中TLR15 在LPS 誘導(dǎo)組與對(duì)照組間存在極顯著差異（p＜0.01），在肺組織和腎組織中差異顯著（p＜0.05）（圖3）。表明法氏囊、脾臟和肝臟是LPS 誘導(dǎo)下產(chǎn)生TLR15 的主要組織。

圖2 東北白鵝TLR15 的免疫組織化學(xué)分析（200×）Fig.2 Immunohistochemical analysis of TLR15 in expression northeast white geese(200×)

2.3 東北白鵝不同組織相關(guān)免疫因子的檢測(cè)采用熒 光 定 量PCR 技 術(shù) 檢 測(cè)IFN-α、IFN-γ、IL-6 和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示（圖4），LPS 誘導(dǎo)組IFN-α在法氏囊和胸腺中轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比差異極顯著（p＜0.01），在肝臟、脾臟和肺中轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組間差異顯著（p＜0.01），而心臟、腎臟和骨髓組織中轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著（p＞0.05）；IFN-γ在法氏囊、骨髓、肝臟和心臟組織中轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比極顯著（p＜0.01），而其它組織則差異不顯著（p＞0.05）；IL-6 在胸腺、心臟、脾臟和肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比差異極顯著（p＜0.01），其它組織與對(duì)照之間差異不顯著（p＞0.05）；IL-1β在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊和骨髓中轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組之間存在差異顯著（p＜0.05），在肺臟和胸腺中轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組間無(wú)顯著差異（p＞0.05）（圖4）。表明在炎癥反應(yīng)中東北白鵝組織內(nèi)TLR15 基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的同時(shí)，信號(hào)通路也陸續(xù)活化，下游的IFN-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6 的轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)。IFN-α和IFN-γ在法氏囊中有最高的轉(zhuǎn)錄水平，IL-6 在胸腺中有最高的轉(zhuǎn)錄水平，IL-1β在各個(gè)組織間轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著，在免疫器官中轉(zhuǎn)錄水平高于其它器官[7]。

3 討 論

Toll 樣受體（TLRs）作為一種模式識(shí)別分子，在天然免疫中發(fā)揮重要作用，目前哺乳動(dòng)物的TLRs 研究得比較透徹，而TLR15 在禽類中研究資料相對(duì)較少。以往研究顯示，雞的TLR15 可以識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖成分，并且在法氏囊中高表達(dá)[13]；在受到未甲基化的CpG-DNA 刺激后，雞TLR15 在法氏囊組織中表達(dá)量也會(huì)明顯上調(diào)[14]；Jie 等在馬立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）感染的第4 d 和第7 d，雞體內(nèi)的TLR15 表達(dá)量也上調(diào)[15]。本研究使用LPS建立東北白鵝雛鵝炎癥模型，檢測(cè)體內(nèi)不同組織TLR15 的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)TLR15 在免疫相關(guān)組織中均上調(diào)，與上述結(jié)果基本一致。邢波建等通過(guò)免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TLR15 在雞脾臟中有很高的表達(dá)，在肺中較少[16]。本研究結(jié)果顯示鵝的法氏囊、脾臟和肝臟組織中也有TLR15 高表達(dá)，表明炎癥因子刺激下，TLR15 的表達(dá)快速上調(diào)，推測(cè)TLR15 在抗炎反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，因此可以應(yīng)用該基因作為抗病基因進(jìn)行品種篩選。

圖3 東北白鵝TLR15 的免疫組織化學(xué)檢測(cè)的灰度分析Fig.3 Gray analysis of immunohistochemistry sections for TLR15 expression in northeast white geese

圖4 TLR15 相關(guān)免疫因子在東北白鵝不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Expression analysis of immune factors excluding TLR15 in different tissues of northeast white geese

有研究證實(shí)，在柔嫩艾美耳球蟲刺激雛雞時(shí)，雞體內(nèi)的TLR15 轉(zhuǎn)錄水平會(huì)上升，同時(shí)MyD88、NF-κB 和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)爆發(fā)式上調(diào)，特別是在盲腸（免疫器官）中有很大的提升[17]；Heidari 等人對(duì)雞進(jìn)行MDV感染后，發(fā)現(xiàn)脾臟中TLR15的表達(dá)量上升，同時(shí)也伴有IL-1β、IL-6、IFN-α和IFN-γ等10個(gè)相關(guān)免疫因子的表達(dá)量上調(diào)[18]；也有報(bào)道利用布拉氏酵母菌（Sb）和枯草芽孢桿菌B10（Bs）刺激三黃雛雞會(huì)導(dǎo)致腸道中TLR2、TLR4 和TLR15 的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，同時(shí)免疫器官中MyD88、IL-6、IL-1β和NF-κB 的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高[19]。上述研究結(jié)果與本研究的結(jié)果基本一致，表明在LPS 誘導(dǎo)下TLR15 和其它免疫相關(guān)因子（IFN-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6）大量表達(dá)，特別是在免疫器官中轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，這使機(jī)體能夠快速應(yīng)對(duì)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，東北白鵝在LPS 誘導(dǎo)下不同組織中TLR15 基因轉(zhuǎn)錄水平會(huì)出現(xiàn)上調(diào)，相關(guān)免疫因子IFN-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6 的轉(zhuǎn)錄水平也不同程度升高；免疫組織化學(xué)分析也表明在法氏囊、脾臟和肝臟中檢測(cè)到高水平的TLR15表達(dá)。本研究為炎癥反應(yīng)條件下，東北白鵝TLR15免疫功能分析提拱了基礎(chǔ)材料，也為鵝的抗病育種研究提供了數(shù)據(jù)支撐。