羅土炎，劉 洋，張志燈，饒秋華，羅 欽，何肖云

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質量安全重點實驗室，福建 福州 350003；2. 福州海關技術中心，福建 福州 350003）

不動桿菌屬（Acinetobacter）菌株廣泛分布于自然界中，主要棲息在水體和土壤中，易生存于潮濕環(huán)境中，目前有效發(fā)布的屬于不動桿菌屬有63 個種，且在不斷增加，其中包括鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii）[1]、魯氏不動桿菌（Acinetobacter lwoffii）[2-3]、溶血不動桿菌（Acinetobacter haemolytius）、約翰遜不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）、醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus），以及新發(fā)現(xiàn)的類魯氏不動桿菌（Acinetobacter pseudolwoffii）等。研究發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬內菌株多為條件致病菌，其中鮑曼不動桿菌引起醫(yī)院內感染頻發(fā)，耐藥菌株不斷增多，因此該屬細菌被廣泛關注[4]。

澳洲墨瑞鱈（Murray cod，Maccullochella peelii peelii），又稱河鱈、東洋鱈、鱈鱸、澳洲淡水鱈鱸等，中國大陸稱為澳洲龍紋斑、蟲紋鱈鱸或蟲紋石斑，是原產(chǎn)于澳大利亞墨瑞河流域的一種著名淡水經(jīng)濟魚類[5-6]，其肉質口感鮮美，營養(yǎng)豐富，目前已成為我國重要的新興的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一，其推動了淡水養(yǎng)殖品種的結構調整。2017 年4 月浙江省樂清市某設施養(yǎng)殖場內，澳洲墨瑞鱈出現(xiàn)腹部腫大，爛尾，部分養(yǎng)殖池出現(xiàn)大量死亡，死亡率達56%。解剖發(fā)現(xiàn)魚腹中有淡紅色腹水，肝臟、腎臟等實質性器官出現(xiàn)充血、腫大，后腸充血糜爛，肌肉有針尖狀出血點。本課題組通過培養(yǎng)特性，全基因測序，在此次患病澳洲墨瑞鱈病灶首次獲得了一株寄魚不動桿菌（Acinetobacter piscicola）LW15[7]，為進一步確定該菌株是否為患病魚致病菌等，本實驗對其進行基因進化分析，致病力及藥物敏感性等檢測，旨在為澳洲墨瑞鱈由該菌引起的疾病有效防治提供理論依據(jù)，并為該病防治積累資料。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料寄魚不動桿菌（Acinetobacter piscicola）LW15 為本實驗室前期分離保存[7]；腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）購自BD 中國代理機構；細菌基因組DNA 提取試劑盒、TaqDNA 聚合酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；試驗中所用引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 16S rDNA 基因擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹構建將純化后的菌株LW15 接種到BHI 液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)16 h，11 000 r/min 離心收集菌體，利用DNA 提取試劑盒提取細菌總DNA 作為模板，采用通用 引 物：27F：5'-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCA G-3'/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'PCR 擴增細菌16S rDNA，擴增產(chǎn)物由福州博尚生物技術有限公司測序，測序結果提交到ezbiocloud（https://www.ezbiocloud.net/）進行比對鑒定。

1.3 動物回歸試驗及致病性檢測按照麥氏比濁法將1.2 中菌液分別配置成濃度為1×109cfu/mL（A組），1×108cfu/mL（B 組）、1×107cfu/mL（C 組）、1×106cfu/mL（D 組）、1×105cfu/mL（E 組）的菌液。將健康澳洲墨瑞鱈在實驗室暫養(yǎng)10 d 后隨機分成6 組，每組30 尾，采用腹鰭基部注射法，分別注射0.5 mL不同濃度梯度的菌液，對照組注射0.5 mL 滅菌PBS（F 組），每組設置3 個平行組。連續(xù)觀察7 d，記錄死亡情況，計算7 d 總平均死亡率。通過IBM SPSS statistics 22.0 軟件計算菌株LW15 對健康澳洲墨瑞鱈的半數(shù)致死濃度（LD50）。同時取回歸感染瀕死澳洲墨瑞鱈潰瘍組織和內臟組織進行細菌的再分離培養(yǎng)與鑒定，以確定致病菌。

1.4 毒力基因分析將菌株LW15 全基因組序列（NIFO00000000）[7]提交到毒力因子數(shù)據(jù)庫（VFDB，Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）進行注釋，獲取基因組中毒力基因信息并進行分析。

1.5 抗生素敏感試驗采用紙片擴散法（K-B 法）進行藥敏試驗，每種藥物設三個重復。28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，取抑菌圈直徑平均值，根據(jù)美國臨床實驗室標準研究所出版的藥敏試驗指南[8]的標準判定菌株對不同藥物的敏感性。質控菌株為大腸桿菌（ATCC25922）。

2 結果與討論

2.1 16S rDNA 序列分析將擴增的菌株LW15 的16S rDNA 序列（1 501 bp）（圖略）提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，登錄號為MF062566。并對該序列進行同源性比對分析，結果顯示其隸屬不動桿菌屬（Acinetobacter），16S rDNA 與Acinetobacter guillouiae CIP 63.46T同源性最高，為97.7%，與其聚集到一個進化分支，但與其它菌株形成相對獨立的進化位置（圖1）。進一步表明該菌為寄魚不動桿菌。

圖1 基于16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰近法）Fig. 1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of LW15 isolate and relative stains.Bar,0.005 Knuc

最近，國內學者從草魚、異育銀鯽、錦鯉等魚類體內分離到致病性廈門不動桿菌、鮑曼不動桿菌、瓊氏不動桿菌等[9-11]；而張涵等研究表明三角帆蚌、銀鯽、青魚、鳙等腸道優(yōu)勢菌群均有不動桿菌屬，推測不動桿菌為淡水魚類腸道優(yōu)勢菌[12]。本實驗分離的寄魚不動桿菌為國內首次從澳洲墨瑞鱈患病魚體內分離獲得。

2.2 回歸感染及致病性試驗結果試驗組澳洲墨瑞鱈在腹鰭基部接種感染初期，表現(xiàn)為游動緩慢，離群獨游或靜止不動，食欲廢絕，腹部貼于池底；解剖患病或瀕死病魚肝臟、腎臟出現(xiàn)充血、腫大，腸壁充血。與自然發(fā)病澳洲墨瑞鱈臨床癥狀和病變相似。同時，從感染瀕死魚體的肝臟內再次分離到寄魚不動桿菌，其形態(tài)、生理生化特征與菌株LW15 一致，表明菌株LW15是此次澳洲墨瑞鱈患病的病原菌。

利用不同濃度梯度的細菌對健康的澳洲墨瑞鱈進行回歸感染后連續(xù)觀察7 d，發(fā)現(xiàn)健康澳洲墨瑞鱈在回歸感染2 d 后，A 組全部死亡，總平均死亡率為100%，4 d 以后B 組、C 組、D 組不再出現(xiàn)死亡，總平均死亡率分別為85.6%、68.9%、34.4%，E 組與對照組未見死亡。經(jīng)計算，菌株LW15 對澳洲墨瑞鱈半致死濃度為4.26×106cfu/mL。

澳洲墨瑞鱈作為新興產(chǎn)業(yè)剛剛起步，關于不動桿菌對其致病性的報道尚較少，本研究通過對本課題組前期分離的寄魚不動桿菌LW15進一步的研究，首次證實該菌株對澳洲墨瑞鱈具有一定的致病性。

2.3 毒力基因檢測結果菌株LW15 的基因大小為3.57×106bp, 通過注釋共得到3243 個編碼蛋白的基因，G+C 含量為37.2 mol%。通過毒力基因數(shù)據(jù)庫注釋發(fā)現(xiàn)菌株LW15 攜帶224 個毒力基因（圖2），其中invasion，adherence 和toxin 等3 類別毒力基因中分別包含2，43 和3 種基因。

圖2 菌株LW15毒力基因預測分類表Fig.2 Prediction classification table of LW15 isolate virulence genes

Invasion毒力因子包含編碼鞭毛生物合成sigma因子和一個調節(jié)蛋白，其中鞭毛自身及其運動性可促進細菌對于宿主細胞的黏附與侵襲，在細菌生物被膜形成過程中起重要作用，與細菌毒力因子的分泌也密切相關，并且鞭毛素蛋白能通過與細胞上Toll 樣受體5（TLR5）結合而誘導機體促炎性反應等[13]。Adherence中包含28 個合成IV 型菌毛的基因，IV 型具有獨特的結構，動力學及生物物理學特征，該類菌毛與菌株的致病性相關[14]，還包含革蘭氏陰性細菌毒素脂多糖及吸附蛋白等。Toxin 毒力因子包含3 條編碼環(huán)化腺苷酸合成酶（Adenylate cyclase，AC）的cya 基因，該基因在沙門菌中充當毒力調節(jié)基因[15]，cya 基因缺失突變株可制作弱毒疫苗，該基因在不動桿菌的功能迄今尚未見報告。此外，在菌株LW15 基因組中預測到ompA 基因，該基因表達外膜蛋白A，參與鮑氏不動桿菌的生物膜形成，在多種致病機制中扮演著重要角色[16]。

生物信息學分析表明菌株LW15 具有相關毒力因子，進一步證明其可能是造成此次浙江省樂清市某養(yǎng)殖廠澳洲墨瑞鱈大量死亡的主要致病菌。

2.4 分離菌的藥敏試驗結果質控菌株ATCC25922的抑菌圈大小在允許范圍內，藥敏結果顯示，菌株LW15 對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、頭孢曲松、丁胺卡那、哌拉西林等21 種藥物敏感；對羧芐西林和呋喃唑酮2 種藥物中度敏感；對四環(huán)素、克林霉素、頭孢拉定、頭孢氨芐、苯唑西林等7 種藥物不敏感（表1），表現(xiàn)出對多種藥物的耐藥。造成該現(xiàn)象的原因包括兩方面，一方面可能是在養(yǎng)殖過程中長期或大量使用該類藥物所造成的耐藥；另一方面是該菌株對這些藥物本身就不敏感[17]；同時，產(chǎn)生藥敏特性差異也可能是由于不同區(qū)域、不同養(yǎng)殖環(huán)境中的菌株受不同藥物環(huán)境作用影響而產(chǎn)生耐藥性變異[18]。耐藥性不動桿菌對養(yǎng)殖魚類的感染不僅危害養(yǎng)殖業(yè)本身，同時，也可能導致人類的食源性感染，從而引發(fā)食品安全問題，必須引起相當?shù)闹匾暋Ｒ虼嗽趯嶋H生產(chǎn)中要科學地使用敏感性抗菌藥物進行疾病治療，預防耐藥性菌株的產(chǎn)生，同時積極改善養(yǎng)殖水體環(huán)境，增強魚體抵抗力。

表1 寄魚不動桿菌（Acinetobacter piscicola）LW15 藥物敏感結果Table 1 Antibiotics sensitivity of Acinetobacter piscicola LW15

隨著澳洲墨瑞鱈工廠化養(yǎng)殖的發(fā)展，其養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的疾病也呈不斷上升趨勢，主要疾病的發(fā)現(xiàn)及防治已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關鍵。本研究為澳洲墨瑞鱈源寄魚不動桿菌病害的防治和澳洲墨瑞鱈高密度循環(huán)水健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化積累了科學資料。