腐竹副產(chǎn)物豆渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌工藝優(yōu)化

陳炳鈿 況應(yīng)谷 王芳婷 時(shí)祥柱*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州350007；2.福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司，福建福州350007）

我國(guó)是豆制品消費(fèi)大國(guó)，每年生產(chǎn)各類豆制品如腐竹、豆?jié){等所產(chǎn)生的副產(chǎn)物——豆渣數(shù)量十分龐大，但由于豆渣口感粗糙，含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，且水分含量高而不利于保存與運(yùn)輸，大部分豆渣作為廢物被棄入環(huán)境造成污染，僅少量作為飼料原料回收利用，造成很大的蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)[1-2]。研究表明，豆渣仍然含有比較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如粗纖維含量達(dá)50%以上，蛋白質(zhì)含量在10%～20%，說明豆渣可以作為很好的膳食纖維和蛋白質(zhì)來源，利用價(jià)值比較高[3-5]。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，通過微生物發(fā)酵可以使豆渣的很多性能得到改善。在飼料工業(yè)中，發(fā)酵后的豆渣不僅風(fēng)味口感得到改善、還能降低抗?fàn)I養(yǎng)因子，延長(zhǎng)保質(zhì)期，減少資源浪費(fèi)及環(huán)境污染等，從而極大提高了其綜合利用價(jià)值[6-10]。如李曉輝等[11]用豆渣來生產(chǎn)納豆芽孢桿菌，可作為飼料添加劑改善動(dòng)物腸道健康。熊俐等[4]使用綠色木霉進(jìn)行豆渣固態(tài)發(fā)酵，極大提高了水溶性膳食纖維的含量，提升了豆渣的利用價(jià)值。這些研究主要是以提高蛋白質(zhì)含量為目標(biāo)，即利用豆渣生產(chǎn)菌體蛋白，從蛋白質(zhì)資源的角度提高豆渣的使用價(jià)值，但從豆渣基質(zhì)生產(chǎn)活性益生菌的研究則非常少。

枯草芽孢桿菌是廣泛應(yīng)用在飼料中的一種微生態(tài)制劑，可明顯提高畜禽尤其是幼齡動(dòng)物的整體健康水平和生長(zhǎng)性能，改善養(yǎng)殖場(chǎng)氣味，降低糞污氨氮含量[11-14]。本研究以腐竹生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物——新鮮豆渣為主要培養(yǎng)基組分，這種新鮮豆渣水分含量高達(dá)83%，加入一定含量的麩皮，麩皮可以使發(fā)酵物料蓬松，降低物料水分，并能提供部分氮源，利用課題組前期篩選的枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)作為發(fā)酵菌種，通過L9（34）正交實(shí)驗(yàn)對(duì)豆渣原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以期獲得富含高活性益生菌的發(fā)酵飼料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豆渣（腐竹加工副產(chǎn)物）為九龍湖生物科技有限公司提供；麩皮購(gòu)買于市場(chǎng)。

1.1.2 供試菌株

枯草芽孢桿菌為課題組篩選鑒定并經(jīng)過工藝優(yōu)化的高產(chǎn)蛋白酶菌株（編號(hào)MK-B108）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液制備

枯草芽孢桿菌保存培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為：葡萄糖2%、豆粕1.5%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%，pH值7.0。32 ℃恒溫培養(yǎng)約16～20 h，將種子液以5%的比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h，獲得發(fā)酵菌液。最終發(fā)酵液菌數(shù)約為5×109cfu/ml。

1.2.2 腐竹豆渣組分分析

粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參考中華人民共和國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15]（GB 5009.5-2010）測(cè)定蛋白質(zhì)；

灰分的測(cè)定：參考中華人民共和國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[16]（GB 5009.4—2016）測(cè)定灰分；

脂肪的測(cè)定：參考中華人民共和國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[17]（GB 5009.6—2016）測(cè)定脂肪。

1.2.3 豆渣發(fā)酵工藝

基礎(chǔ)物料配制與接種：將新鮮豆渣（含水83%）與麩皮按一定比例混合后，加入1%氯化鈉，接種枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，然后置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，濕度保持85%。

1.2.4 豆渣發(fā)酵pH值的確定

通過單因素考察實(shí)驗(yàn)確定以豆渣/麩皮為培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)的最適pH值，將豆渣∶麩皮按9∶1的比例混合，接種發(fā)酵液10%，用磷酸鹽緩沖液（2 mol/l）調(diào)節(jié)到不同的pH 值，在溫度32 ℃、濕度85%條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，3 d后取樣測(cè)定芽孢數(shù)，樣品干燥至恒重后測(cè)定小分子蛋白含量。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交實(shí)驗(yàn)考察4 個(gè)主要因素：A 豆渣/麩皮比例（%）、B接種量（ml）、C發(fā)酵溫度（℃）、D發(fā)酵時(shí)間（d），每個(gè)因素設(shè)3 個(gè)水平，以發(fā)酵后芽孢數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，各因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

1.2.6 發(fā)酵豆渣組分測(cè)定

1.2.6.1 芽孢計(jì)數(shù)

采用平板活菌計(jì)數(shù)法，準(zhǔn)確稱取1 g 發(fā)酵后的豆渣樣品，按10 倍稀釋成不同濃度的稀釋液，從3 個(gè)合適的稀釋液中分別吸取100 μl 置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度做2～3 個(gè)平行。37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.6.2 小分子蛋白含量的測(cè)定

取1 g 發(fā)酵豆渣溶于50 ml 蒸餾水中，調(diào)pH 值至4.5 后進(jìn)行沉淀，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，用Folin-酚法測(cè)定蛋白含量。

1.2.6.3 胰蛋白酶抑制因子活性分析

胰蛋白酶抑制因子活性的測(cè)定參照盧曉凌等[18]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 豆渣成分測(cè)定

新鮮豆渣為半固體白色松散狀微粒，含水83%，經(jīng)測(cè)定，濕態(tài)豆渣粗脂肪為1.8%，粗灰分為2.6%，粗蛋白質(zhì)為3.35%，其中小分子蛋白占比為5.8%，換算成干基物料后，豆渣各組分含量如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)用豆渣主要成分（干基，%）

2.2 固態(tài)發(fā)酵pH值的確定

圖1 發(fā)酵pH值差異對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)室所用的枯草芽孢桿菌為高產(chǎn)蛋白酶菌株，該菌種液態(tài)發(fā)酵時(shí)最適生長(zhǎng)pH 值為7.0，為了確定以豆渣/麩皮為培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)的最適pH 值，進(jìn)行了單因素考察實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1、圖2 所示。由圖1 可知，以豆渣、麩皮為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，pH 值對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)影響很大，尤其是pH 值超過7.2 后，菌體生長(zhǎng)明顯減緩。與此同時(shí)，小分子蛋白含量變化趨勢(shì)跟芽孢發(fā)酵結(jié)果相同(見圖2)。該實(shí)驗(yàn)確定了發(fā)酵最適pH 值為6.8，在接下來的正交實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵酸堿度統(tǒng)一調(diào)到pH 值6.8 進(jìn)行。

圖2 發(fā)酵pH值差異對(duì)小分子蛋白含量的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

設(shè)計(jì)了L9（43）正交實(shí)驗(yàn)對(duì)豆渣/麩皮比例、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4 個(gè)參數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果如表3所示。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行均值分析，飼料中活菌數(shù)量的影響排列順序?yàn)椋篈2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C1＞C3，D2＞D1＞D3。由極差可以看出，4種因素對(duì)飼料中活菌數(shù)量的影響由大到小的順序是：接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞豆渣/麩皮比例＞發(fā)酵溫度。因此確定最佳條件組合為：A2B3C2D2，即新鮮豆渣固態(tài)發(fā)酵時(shí)與輔助培養(yǎng)基組分麩皮的最佳復(fù)配比例為8∶2，最適發(fā)酵溫度為35 ℃，最適pH 值為6.8，芽孢桿菌發(fā)酵液最佳接種量為15%，發(fā)酵時(shí)間為3 d。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 最適發(fā)酵條件下豆渣發(fā)酵前后對(duì)比

在上述最適條件下經(jīng)過3 d 恒溫恒濕發(fā)酵后，濕態(tài)豆渣培養(yǎng)基含枯草芽孢桿菌活性芽孢數(shù)達(dá)2.77×109cfu/g，豆渣發(fā)酵前后粗蛋白質(zhì)、小分子蛋白質(zhì)、胰蛋白酶抑制因子活性變化如表4 所示?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵過程中分泌的蛋白酶能夠有效水解大豆蛋白，發(fā)酵產(chǎn)物中小分子蛋白質(zhì)含量高達(dá)9.7%，大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子胰蛋白酶抑制劑活性大幅降低。經(jīng)干燥處理后，活性芽孢數(shù)為1.25×1010cfu/g，發(fā)酵后的豆渣已由低值飼料原料轉(zhuǎn)化為高價(jià)值的活性益生菌生物發(fā)酵飼料。跟原始的豆渣相比，發(fā)酵后的豆渣利用價(jià)值大大提高，在飼料中只需極少的添加量，就可以達(dá)到改善動(dòng)物腸道健康，提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能的目的。

表4 豆渣發(fā)酵前后各組分變化（干基）

豆渣單純作為飼料原料，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極為低廉，而且新鮮豆渣極易腐敗變質(zhì)，干燥可以延長(zhǎng)使用時(shí)間，但干燥成本遠(yuǎn)高于利用價(jià)值[19]。豆渣中含豐富的蛋白質(zhì)，同時(shí)也存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，例如胰蛋白酶抑制因子、植酸等典型代表。它們的存在對(duì)生物體內(nèi)某些消化酶起抑制作用，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)絡(luò)合成不易消化的成分，使得豆渣的消化率和動(dòng)物的利用率下降[20-23]。很多學(xué)者利用微生物發(fā)酵的方法，本質(zhì)上改變了豆渣的原料屬性，何曉哲[24]使用黑曲霉與綠色木霉組合液態(tài)發(fā)酵豆渣，將可溶性膳食纖維（Soluble Dietary Fiber，SDF）含量提高了4.46倍，蛋白質(zhì)含量也獲得大幅提高；潘天玲等[25]使用真菌微生物組合，包括黑曲霉、綠色木霉、啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母，復(fù)配麩皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵以生產(chǎn)菌體蛋白，發(fā)酵后豆渣粗蛋白含量也提高到了28%以上；管瑛等[26]使用米根霉和少孢根霉組合對(duì)豆渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵過程中還原糖含量、可溶性蛋白含量、纖維素酶活力等，證明用米根霉和少孢根霉發(fā)酵豆渣可以提高豆渣的營(yíng)養(yǎng)成分及抗氧化活性。這些研究主要是以提高蛋白質(zhì)含量為目標(biāo)，即利用豆渣生產(chǎn)菌體蛋白，從蛋白質(zhì)資源的角度提高豆渣的使用價(jià)值，但從豆渣基質(zhì)生產(chǎn)活性益生菌的研究則非常少。本研究以獲取高活力益生菌芽孢為出發(fā)點(diǎn)，發(fā)酵后的豆渣不僅營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)得到改善，還能夠起到改善動(dòng)物腸道健康，提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能的作用。

3 結(jié)論

本研究以新鮮豆渣為研究對(duì)象，通過復(fù)配疏散性發(fā)酵基質(zhì)麩皮，接種枯草芽孢桿菌進(jìn)行益生菌的生產(chǎn)，經(jīng)研究，最佳復(fù)配比例為豆渣∶麩皮為8∶2，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液接種量為15%，發(fā)酵溫度為35 ℃，發(fā)酵初始pH 值為6.8，發(fā)酵時(shí)間為3 d。發(fā)酵后的豆渣含活性芽孢數(shù)為1.25×1010cfu/g，小分子蛋白質(zhì)含量為9.7%，同時(shí)豆渣中的胰蛋白酶抑制因子極顯著降低。本研究選用了優(yōu)化的枯草芽孢桿菌，該菌株產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)，應(yīng)用在畜禽日糧中，不僅可以調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道菌群平衡，還可以通過產(chǎn)生復(fù)合蛋白酶系，提高原料蛋白的消化和利用率。本研究將低值的腐竹副產(chǎn)物——豆渣轉(zhuǎn)化為高附加值的功能性益生菌產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)了資源的循環(huán)利用。