ELISA 法檢測家禽活疫苗中禽白血病病毒污染的測量不確定度評估

（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

禽白血病是由禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）引起的一種以免疫抑制、生長抑制和髓細胞癌變?yōu)樘攸c的傳染性致骨髓細胞瘤疾病或成髓性白血病[1]。家禽活疫苗中ALV 的污染和傳播是引起禽白血病流行的重要原因。因此，家禽活疫苗中ALV 污染檢測對提高生物制品安全性非常重要[2]。

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法是具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、所需設備較少、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點，成為近年來病毒檢測方法中發(fā)展最快，應用最廣的一種方法。用ELISA 法測定家禽活疫苗中ALV 污染狀況，其測量結果的可信度很大程度上取決于不確定度的大小。測量不確定度是與測量結果相關聯(lián)的參數，表征合理賦予被測量值的分散性。測量不確定度用標準偏差表示時，稱為標準不確定度，如用說明了置信水準區(qū)間的半寬度表示方法，則為擴展不確定度。在家禽活疫苗的ALV 污染檢測結果中引入測量不確定度[3-4]，目的在于分析不確定度的來源并對其量化，有助于檢測人員關注檢測關鍵環(huán)節(jié)，提高檢測結果的準確性，并為獸醫(yī)實驗室開展相關工作提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 雞新城疫活疫苗（La Sota 株）、雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120 株）、雞傳染性法氏囊活疫苗（B87 株）和“雞新城疫、傳染性支氣管炎”二聯(lián)活疫苗（La Sota 株+QXL87 株）。

1.1.2 試劑 ALV ELISA 檢測試劑盒、雞新城疫病毒陽性血清、雞傳染性法氏囊病毒陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 儀器 酶標儀（型號SUNRISE），瑞士Tecan 公司產品；10～100 μL 單道移液器、30～300 μL多道移液器，Eppendorf 公司產品；恒溫生化培養(yǎng)箱（型號SHP-150），上海精宏實驗設備有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 每批疫苗按照2015年版《中華人民共和國獸藥典》三部附錄中的ALV 檢驗法處理并接種雞胚成纖維細胞，培養(yǎng)5 d，按常規(guī)方法消化、收獲細胞；將其中1/2 收獲的細胞作為第一代細胞培養(yǎng)物（P1樣品），其余細胞繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d 后，按同樣方法收獲細胞，作為第二代細胞培養(yǎng)物（P2樣品）。按同樣方法培養(yǎng)收獲第三代細胞培養(yǎng)物（P3樣品）[5]。將連續(xù)3 代細胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品反復凍融3 次，離心，取上清作為每批疫苗的待檢樣品。

1.2.2 測量不確定度來源分析 測量不確定度評定分為：A 類評定（uA），即重復樣本檢測引入的不確定度；B 類評定（uB），即可能影響測量結果的因素。根據檢測原理、試劑盒說明書分析，本試驗的不確定度主要是移液器加樣量、溫育時間、溫育溫度、酶標儀測量。

1.2.3 測量不確定評定

1.2.3.1 測量樣品重復性引入的不確定度評定利用ALV ELISA 檢測試劑盒檢測各樣品的OD650nm值，每批疫苗的連續(xù)3 代細胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品分別重復測定6 次[5]，按照文獻[3]計算標準不確定度相對標準不確定度。其中，為樣品平均值，Sxi為樣品重復檢測的標準差，xi為每次重復的測量值，n為重復次數。

1.2.3.2 移液器加樣引入的不確定度評定 移液器加樣產生的不確定度包括移液器容量誤差產生的不確定度uC和溫度效應產生的不確定度uT[3，6-7]。移液器容量誤差產生的不確定度uC，根據移液器校準證書獲得100 μL 和300 μL 移液器在100 μL檢定點的容量允許誤差為±2%，按矩形分布處理計算uC=（100 μL×2%）。溫度效應產生的不確定度uT，設定溫度為20 ℃時水的膨脹系數為2.1×10-4/℃，實驗室溫度為（20±4）℃，ELISA試驗中每次加樣量為100 μL，按照矩形分布計算uT=100 μL×4×2.1×10-4。由于移液器容量誤差和溫度效應是2 個相互獨立的分量，故移液器加樣引入的標準不確定度。本次試驗共有4 步加樣過程（100 μL 樣品、100 μL 酶結合物、100 μL 顯色液、100 μL 終止液），且相互獨立，故加樣過程中引入的標準不確定度，相對標準不確定度uB1=uV2/100 μL。

1.2.3.3 酶標儀產生的不確定度評定 依據酶標儀校準證書，設定吸光度的示值誤差為0.004，按照均勻統(tǒng)計分布計算標準差，按照文獻[6-7]計算酶標儀對每個樣品的相對標準不確定度

1.2.3.4 溫育時間的不確定度評定 ELISA 試驗中，孵育時間為（60±2）min，按照均勻統(tǒng)計分布計算標準差，共孵育2 次，依據文獻[3]計算溫育時間的相對標準不確定度

1.2.3.5 溫育溫度的不確定度評定 ELISA 試驗共需孵育2 次，孵育的溫度均為37 ℃，在使用電熱恒溫培養(yǎng)箱時，溫度波動范圍為±1 ℃，根據均勻統(tǒng)計分布計算標準差，依據文獻[3]計算溫育溫度的相對標準不確定度

1.2.4 合成標準不確定度 因以上各分量互不相關，故合成不確定度就是將各個影響因素算出來的不確定度合在一起的過程，即將各個影響因素不確定度的2 次方加在一起，再開平方根，計算公式

1.2.5 擴展不確定度 擴展不確定度（U）以標準偏差的倍數表示。在ELISA 試驗中一般使用2倍擴展不確定度，即k=2。當置信概率p=95%時，包含因子k=2，U=u×k，計算每批疫苗連續(xù)3 代細胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品的擴展不確定度。

1.2.6 測量不確定度報告 得出ELISA 試驗的不確定度后，表示為X=x±U。x為實際樣品的OD650nm值，U為不確定度，X表示被檢樣品的標準的OD650nm值所在的區(qū)間。

1.2.7 檢測結果判定 根據ALV ELISA 試劑盒的結果判定標準，待檢樣品OD650nm值大于或等于0.300 判為陽性，小于0.300 判為陰性。如果疫苗的連續(xù)3 代細胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品的OD650nm值都小于0.300，即這批疫苗沒有ALV 污染；疫苗的連續(xù)3 代細胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品中只要有1個樣品的OD650nm值大于或等于0.300，即可判定這批疫苗有ALV 污染。

2 結果與分析

2.1 不確定度分量評定

2.1.1 測量樣品重復性引入的不確定度評定 為獲得重復性測量不確定度，對同一樣品進行6 次測定，測量值xi、平均值X、標準差Sxi、標準不確定度uA和相對標準不確定度uA1的結果見表1～4。從表中可以看出，每個樣品重復測定6 次，測量值xi是不相同的。測量不確定度用標準差表示時，就是標準不確定度，反應每個樣品測量值的分散性。標準不確定度除以平均值就是相對標準不確定度，4 批疫苗的每個樣品相對標準不確定度范圍在0.02～0.04 之間。

表3 雞傳染性法氏囊活疫苗（B87 株）樣品重復測定結果（n=6）

表4 雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota 株+QXL87 株）樣品重復測定結果（n=6）

2.1.2 移液器加樣引入的不確定度評定

2.1.2.1 容量誤差產生的不確定度 根據移液器容量允許誤差，按矩形分布處理計算的移液器引入的標準不確定度

2.1.2.2 溫度效應產生的不確定度 依據20 ℃時水的膨脹系數、實驗室溫度波動范圍，按照矩形分布計算的溫度效應引入的標準不確定度uT=100 μL×4×2.1×10-4=0.084 μL。

2.1.2.3 加樣引入的標準不確定度 移液器加樣引入的標準不確定度由移液器容量誤差和溫度效應2 個相互獨立的分量，按公式計算得出，

2.1.2.4 加樣引入的綜合標準不確定度和相對不確定度 本試驗共有4 步加樣過程且相互獨立，故加樣過程中引入的綜合標準不確定度，相對標準不確定度uB1=uV2/100 μL=2.315 504 μL/100 μL=0.023 155。4 批疫苗每個樣品移液器加樣的相對標準不確定度都相同，均為0.023 155。

2.1.3 酶標儀產生的不確定度評定 酶標儀的校準證書給出吸光度的示值誤差為0.004，按照均勻統(tǒng)計分布計算，標準差為，計算得出酶標儀對每個樣品的相對標準不確定度。測量每個樣品的酶標儀標準差相同，但每個樣品的平均值不同，導致酶標儀對每個樣品的相對標準不確定度不同，由表5 可見，4 批疫苗的相對標準不確定度在0.038～0.046之間。

2.2 合成標準不確定度

根據公式計算每批疫苗樣品的合成標準不確定度，結果見表6～9。從表中可以看出，樣品的平均值在0.050～0.060 之間，樣品的合成標準不確定度在0.003～0.004 之間。

2.3 擴展不確定度

當置信概率p=95%時，包含因子k=2，根據公式U=u×k，計算每批疫苗每個樣品的擴展不確定度，結果見表6～9。從表中可以看出，樣品的平均值X范圍在0.050～0.060 之間，樣品的擴展不確定度在0.007～0.008 之間。

2.4 測量不確定度報告

用測量結果的標準形式X=x±U表示每批家禽活疫苗每個樣品測量結果，并進行有效數字修正，結果見表6～9。

2.5 檢測結果判定

從表6～9 中可以看出，每批家禽活疫苗的連續(xù)3 代細胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品ALV OD650nm值不確定度范圍在0.040～0.070 之間，上限值均小于0.300，判定為陰性，即所檢測4 批活疫苗中沒有ALV 污染。

3 討論

測量不確定度是對測量結果質量的定量表征。測量結果的可信程度在很大程度上取決于其不確定度大小，而測量結果必須附有不確定度說明才是完整并有意義的。ELISA 檢測中引入測量不確定度的概念后，給ELISA 的檢測值賦予分散性，將檢測值由原來的“點”變?yōu)椤岸巍?，可有效降低誤判風險。本研究中，用ELISA 法檢測4 批家禽活疫苗中ALV 污染情況，在測量的OD650nm值中，加入測量不確定度，提升了測量結果的可信度。杜鵑[6]在口蹄疫病毒O 型抗體液相阻斷ELISA 試驗中，引入ELISA 的測量不確定度，提升了測量結果的可信度，并有效降低了假陽性、假陰性出現的風險；史喜菊等[8]在牛布魯氏菌補體結合試驗中，引入測量不確定度，使測量結果的質量判定有了定量依據。

表5 酶標儀對每個樣品的相對標準不確定度

表6 雞新城疫活疫苗（La Sota 株）樣品各個不確定度評定結果

表7 雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120 株）樣品各個不確定度評定結果

表8 雞傳染性法氏囊活疫苗（B87 株）樣品各個不確定度評定結果

表9 雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota 株+QXL87 株）樣品各個不確定度評定結果

本研究中，4 批家禽活疫苗的禽白血病病毒的OD650nm值遠遠小于0.300，加入測量不確定度，對于結果的判定影響不大。假如測得的樣品OD650nm值接近臨界值0.300，加入測量不確定度，就可以降低誤判風險。家禽活疫苗的外源ALV 的檢驗中，加入測量不確定度，可提升測量結果的可信度和降低誤判風險，排除一切ALV 污染，從而給廣大養(yǎng)殖生產企業(yè)提供真正純凈疫苗，為家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展保駕護航。

用ELISA 法檢測家禽活疫苗中ALV 污染的不確定度來源多樣，既有樣品重復檢測引入的A 類不確定度，又有移液器、酶標儀及溫育溫度和溫育時間測量誤差等引入的B 類不確定度。在所討論的影響測定結果不確定度的因素中，酶標儀測量和重復檢測對不確定度結果的影響最大；移液器加樣、溫育溫度和溫育時間對不確定度影響程度較小。酶標儀測量引入的不確定度可以通過良好的儀器使用習慣，嚴格按照儀器的期間核查規(guī)程、維護規(guī)程進行核查和維護，并合理利用檢定校準數據進一步減小酶標儀測量引入的不確定度；采用ELISA 法測定家禽活疫苗中ALV 污染的過程中，應盡可能增加重復試驗次數，以減少樣品重復性試驗導致的不確定度，從而減少檢測的總不確定度；應嚴格控制試驗反應條件，選擇精密度高、誤差小的移液器，從而減小由其引入的不確定度，以提高檢測質量。