豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重熒光RT-PCR 檢測方法的建立

張宏偉，王建華，陳本龍，麻麗丹，宋 喆，蒲 靜

（1.西華師范大學生命科學學院，四川南充 637002；2.天津海關(guān)，天津 300456；3.丹東海關(guān)，遼寧丹東 118002；4.北京海關(guān)，北京 100026）

在病毒學分類中，豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）均屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，為單股、正鏈RNA 病毒，具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，其基因組全長約12.3 kb，由5'非編碼區(qū)（5'UTR）、1 個大的開放閱讀框和3'非編碼區(qū)（3'UTR）組成，編碼1 個含有約4 000 個氨基酸的前體多聚蛋白。該前體多聚蛋白在宿主細胞信號肽酶和病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的作用下，被加工為病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由CSFV引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，曾給我國養(yǎng)豬業(yè)造成很大經(jīng)濟損失[2]。自20 世紀50年代以來，通過實施CSFV 兔化弱毒苗免疫接種，我國CSF 疫情已得到有效控制，發(fā)病率和死亡率顯著降低，但以非典型、低齡化和散發(fā)性為特點的非典型CSF 在各地時有發(fā)生[3]。早在1971年，Stewart 等[4]就觀察到BVDV 對豬的自然感染現(xiàn)象；1996年，王新平等[5]從我國疑似CSF 病料中檢出BVDV。近年來豬的BVDV 感染在我國部分地區(qū)豬群中呈散發(fā)性、地方性流行態(tài)勢[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，豬感染BVDV 后可產(chǎn)生類似慢性CSF 的臨床癥狀和病理變化，從而干擾CSF 的臨床診斷[9]。此外，豬感染BVDV 后產(chǎn)生的BVDV 抗體對CSFV 有一定的抑制作用，會影響CSF 疫苗的免疫效果[9]。因此，了解豬群中的BVDV 感染狀況，對于防范豬群BVDV 感染和做好CSF 防制和凈化工作具有重要指導意義。

近年來，國內(nèi)外研究人員根據(jù)CSFV 和BVDV 基因組各自的5'端的保守區(qū)，已建立了多種單一的檢測CSFV 和BVDV 的熒光RT-PCR 方法[10-13]，而同時檢測豬源臨床樣本中的CSFV 和BVDV 的雙重熒光RT-PCR 檢測方法則少見報道。為此，本研究以CSFV 與BVDV 的5'端保守區(qū)為擴增靶序列，設計特異性引物和TaqMan 探針，建立了一種同時鑒別檢測CSFV 與BVDV 的雙重熒光PCR 檢測方法，為CSF 防制和凈化提供了一種有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒、RNA 標準對照和主要試劑

CSFV、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）以 及BVDV NADL 株（BVDV-1）和890 株（BVDV-2）的核酸材料，由天津海關(guān)動植物與食品檢測中心反芻動物檢疫實驗室保存。TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time），購自大連寶生物工程（北京）有限公司。RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7，購自Promega 公司。

1.2 引物和探針設計與合成

根據(jù)GenBank 發(fā)表的CSFV 毒株基因序列（AJ133738.1）、BVDV-1 型NADL 毒株基因序列（AJ133738.1）和BVDV-2 型890 毒株基因序列（AF039180.1），在NCBI 網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov/），對這3 株病毒的5'UTR 序列進行BLAST序列比對，選取BVDV-1 型和BVDV-2 型5'UTR 序列的共同保守序列設計合成引物對和探針，選取CSFV 5'UTR 序列的保守序列設計合成引物對和探針，由Sangon Biotech 公司合成。經(jīng)預試驗確定的引物及探針序列見表1，擴增片段長度為91 bp。

表1 引物與探針序列

1.3 標準RNA 對照制備

分別選取CSFV 毒株、BVDV-1 型NADL 毒株和BVDV-2 型890 毒株的5'UTR 序列，送由上海杰瑞生物技術(shù)公司合成并克隆至PCR2.1 載體連接，構(gòu)建重組克隆載體PCR2.1-CSFV-5'UTR、PCR2.1-BVDV-1-5'UTR 和PCR2.1-BVDV-2-5'UTR，然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細胞；在AMP+LB 平板上挑選單個菌落，接種于新鮮AMP+LB 培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；以經(jīng)PstI 酶切線性化的重組質(zhì)粒DNA 為模板，采用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7試劑盒，按說明書進行體外轉(zhuǎn)錄；對體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，經(jīng)RQ1 DNA 酶消化及純化后即制備成含有擴增靶序列的RNA 標準對照，分別命名為CSFV-5'UTRRNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTRRNA；用核酸蛋白分析儀測定其濃度并按相應公式換算其拷貝數(shù)，濃度分別為2.7×109、3.6×109和3.2×109拷貝/μL。

1.4 熒光RT-PCR 反應條件優(yōu)化

采 用One Step PrimeScript ? RT-PCR Kit（Perfect Real Time）試 劑，在Light Cycler?480 Ⅱ熒光PCR（Rochi）儀上，以CSFV-5'UTRRNA（2.7×106拷 貝/μL）、BVDV-1-5'UTR-RNA（3.6×106拷 貝/μL）和BVDV-2-5'UTR-RNA（3.2×106拷貝/μL）為膜板，首先確定在25 μL反應體系中的各條引物和探針的最適濃度，然后確定最適退火和擴增溫度，進而確定最適熒光RTPCR 反應條件。

1.5 標準曲線繪制和敏感性試驗

對CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA 進行10 倍系列稀釋，然后分別吸取1 μL，按優(yōu)化的熒光RT-PCR 反應條件進行試驗；反應結(jié)束后，以Ct 值為橫坐標、標準RNA 對照模板起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標，繪制定量標準曲線，同時確定檢測標準RNA 對照模板的最低拷貝數(shù)。

1.6 重復性試驗和特異性試驗

對3 個濃度的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 各 取1 μL 為模板，分別進行組內(nèi)試驗和組間試驗，確定該方法的重復性。以CSFV、BVDV、PRRSV、PEDV 和TGEV 的核酸為模板，按優(yōu)化反應條件進行試驗，確定該熒光RT-PCR 方法的特異性。

1.7 臨床樣本檢測

對2017—2019年本實驗室保留的采自國內(nèi)豬場和屠宰場的152 份豬淋巴結(jié)樣本，用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 試劑盒提取樣本RNA，采用GB/T 27540—2011 的實時熒光RT-PCR（簡稱國標方法）進行CSFV 核酸檢測，采用OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》（2018版第3.4.7 章）的熒光RT-PCR（簡稱OIE 方法）進行BVDV 核酸檢測，同時采用本研究所建立的方法進行CSFV 和BVDV 核酸檢測，以評價該方法的實用性和符合率。

2 結(jié)果

2.1 熒光RT-PCR 反應條件優(yōu)化

在Light Cycler? 480 Ⅱ熒光PCR（Rochi）儀上，以CSFV-5'UTR-RNA（2.7×106拷貝/μL）、BVDV-1-5'UTR-RNA（3.6×106拷 貝/μL）和BVDV-2-5'UTR-RNA（3.2×106拷貝/μL）為模板，進行不同濃度組合的引物和標記探針以及56～61 ℃范圍內(nèi)退火延伸溫度的優(yōu)化試驗。試驗確定的CSFV 和BVDV 雙重熒光RT-PCR 反應體系為：在25 μL 反應體系中，依次加入2×One Step RT-PCR buffer Ⅲ12.5 μL，TaKaRa ExTaqHS（5 U/μL）0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，BVDV-F（10 mmol/L）、BVDV-R（10 mmol/L）、BVDV-P（4 mmol/L）、CSFV-F（10 mmol/L）、CSFV-R（10 mmol/L）、CSFV-P（4 mmol/L）各0.5 μL，模板1 μL，補足水至25 μL。反應參數(shù)為：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45 個循環(huán)。在每次循環(huán)的60 ℃延伸擴增結(jié)束前，采集FAM 和HEX 通道的熒光信號。最適反應條件下的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 的動力學曲線分別見圖1-A、1-B 和1-C。

2.2 定量標準曲線及最低檢出限

圖1 熒光RT-PCR 動力學曲線

對10 倍系列稀釋的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA，按優(yōu)化后的雙重熒光RT-PCR 反應條件進行檢測，擴增曲線分別見圖2-A、2-B 和2-C；以起始模板濃度的對數(shù)為X 軸、Ct 值為Y 軸，繪制成的標準曲線分別見圖3-A、3-B 和3-C。對CSFV-5'UTRRNA 的定量檢測的線性范圍為2.7×101～2.7×108拷貝/μL，線性關(guān)系表達式為Y=-3.476X+41.7，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999；對BVDV-1-5'UTR-RNA 的定量檢測的線性范圍為3.6×101～3.6×109拷貝/μL，線性關(guān)系表達式為Y=-3.451X+41.53，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999；對BVDV-2-5'UTR-RNA 的線性范圍為3.2×101～3.2×109拷貝/μL，線性關(guān)系表達式為Y=-3.39X+41.39，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999。由圖3-A、3-B 和3-C 可知，該方法對CSFV-5'UTRRNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTRRNA 最低可分別檢出27、36 和32 拷貝/μL。

圖2 熒光RT-PCR 擴增曲線

2.3 重復性試驗

分別選取3 個濃度的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 標 準對照為模板，按優(yōu)化的反應條件進行組內(nèi)和組間重復試驗，每個稀釋度的Ct 值和標準差（SD）及變異系數(shù)（CV）分別見表2、表3 和表4。由表可見，組內(nèi)和組間重復試驗的Ct 值變異系數(shù)均小于1.5%，表明本試驗所建立的熒光RT-PCR 檢測體系穩(wěn)定，具有良好的重復性。

2.4 特異性試驗

用所建立的方法同時對CSFV、BVDV、PRRSV、PEDV 和TGEV 的核酸材料進行檢測，擴增結(jié)果見圖4。由圖可知，僅CSFV 和BVDV的核酸呈現(xiàn)典型的擴增曲線，而PRRSV、PEDV和TGEV 的核酸材料均無擴增曲線出現(xiàn)，表明本研究建立的熒光PCR 方法具有良好的特異性。

圖3 熒光RT-PCR 標準曲線

表2 CSFV-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復性試驗結(jié)果

表3 BVDV-1-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復性試驗結(jié)果

表4 BVDV-2-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復性試驗結(jié)果

圖4 二重熒光RT-PCR 檢測VDV 和CSFVB 的特異性

2.5 臨床樣本檢測

在152 份豬淋巴結(jié)樣本中，用國標方法檢出CSFV 核酸陽性樣品17 份，其余樣品為CSFV 核酸陰性，用OIE 方法檢出BVDV 核酸樣品4 份，其余樣品為BVDV 核酸陰性。對這152 份豬淋巴結(jié)樣本，用本研究所建立方法檢出單一CSFV 核酸陽性樣品16 份、單一BVDV 核酸陽性樣品3 份、CSFV 核酸和BVDV 核酸雙陽性的樣品1 份，檢測結(jié)果與國標方法和OIE 方法一致。

3 討論

流行病學研究表明，繁殖母豬的CSFV 持續(xù)感染是引發(fā)仔豬發(fā)生CSF 的源頭。疫病凈化是根除動物疫病最經(jīng)濟的有效手段。因此，加大種豬場CSF 病原學監(jiān)測力度，堅決淘汰感染母豬，培育陰性種豬群和后備種豬群，是實現(xiàn)種豬場的CSF 凈化乃至根除的有效措施。目前我國已開始實施了種豬場CSF 凈化計劃，通過實施CSF 凈化顯著提高了養(yǎng)豬企業(yè)經(jīng)濟效益，減少了疫病損失并大大降低了防疫成本[14]。然而。在種豬及生豬生產(chǎn)實際工作中，接種使用BVDV 污染的胎牛血清和牛睪丸制備的CSF 細胞疫苗，或者飼喂污染BVDV 的飼料，均可造成豬的BVDV 感染[15-16]。這不僅增加了CSF 診斷和防制的復雜性，也給種豬場的CSF陰性種豬群和后備種豬群的評價帶來干擾。因此，在豬群中開展CSFV 和BVDV 檢測，對我國CSF的防控和凈化及無病場（區(qū)）的評價具有重要的實際應用價值。

多重實時熒光PCR 方法可同時檢測多種病原核酸，具有一次擴增反應就能快速、敏感、特異地鑒別和檢測多種病原的優(yōu)點?；贑SFV 與BVDV 的5'端保守區(qū)，設計特異性引物和TaqMan探針，本研究建立了一種同時檢測CSFV 與BVDV的雙重熒光PCR 檢測方法。試驗結(jié)果表明，該方法僅對CSFV 與BVDV 呈現(xiàn)特異性擴增，不與PRRSV、PEDV 和TGEV 等常見相關(guān)豬病病毒發(fā)生交叉反應，最低可分別檢出27 個拷貝數(shù)的BVDV-1-5'UTR-RNA 對照、36 個拷貝數(shù)的BVDV-2-5'UTR-RNA 對照和32 個拷貝數(shù)的CSFV-5'UTRRNA 對照。該方法的組內(nèi)試驗和組間試驗的Ct 值變異系數(shù)介于0.11%～1.20%，具有良好的重現(xiàn)性。對152 份國內(nèi)豬組織樣本的檢測結(jié)果表明，本研究建立的方法與對應的國標和OIE 方法的檢出結(jié)果一致，且具有節(jié)省試劑和檢測效率高的優(yōu)點，可用于豬淋巴結(jié)等臨床樣本中CSFV 與BVDV 的同時檢測。