GC-FID內(nèi)標(biāo)法測定復(fù)方丹參制劑醇沉上清液乙醇含量*

趙 波，熊皓舒，趙萬順，章順楠

（1.中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京211198；2.中藥先進(jìn)制造技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，天津 300400）

復(fù)方丹參制劑具有活血化瘀、理氣止痛的功能，臨床上療效顯著，常用于治療氣滯血瘀所致的胸痹、冠心病、心絞痛[1]等癥。而產(chǎn)品療效的發(fā)揮水平，很大程度上受制于生產(chǎn)工藝，作為制劑生產(chǎn)過程中主要的純化精制步驟，醇沉[2，3]工藝的地位舉足輕重。上清液含醇量是醇沉工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)，對有效成分的保留率、無效成分的除去率均具有顯著的調(diào)節(jié)作用。含醇量過高或過低，均難以最大程度地保留有效成分、除去雜質(zhì)，有時甚至引起有效成分的大量損失，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此，上清液含醇量的測定成為中藥制劑醇沉工藝過程中亟需關(guān)注的問題。

目前，在中藥制劑實(shí)際生產(chǎn)中，含醇量的確定方式主要包括酒精計法、計算法、倍數(shù)法[4]。酒精計法是將酒精計插入醇沉液中讀取示數(shù)，確定目標(biāo)含醇量。酒精計根據(jù)不同比例乙醇與水混合后密度不同的原理制成，只適用于不含溶質(zhì)的乙醇、水簡單體系。但在加醇過程中，乙醇液溶解了大量干物質(zhì)[5]，比重較大，測量時酒精計上浮，示數(shù)偏小，需不斷添加乙醇才能達(dá)到目標(biāo)含醇量，導(dǎo)致醇沉終點(diǎn)實(shí)際含醇量大于目標(biāo)含醇量。計算法與倍數(shù)法本質(zhì)上一致，普遍做法是以待醇沉浸膏體積為基準(zhǔn)，通過計算加醇的方式，確定目標(biāo)含醇量。但其混淆了浸膏體積與浸膏中水體積的概念[6]，導(dǎo)致實(shí)際含醇量大于目標(biāo)含醇量。因此，亟需建立精密度、準(zhǔn)確度高的乙醇含量檢測方法，用于醇沉上清液含醇量的測定。氣相色譜法[7]以氦或氬等作為載氣，通過將混合物樣品注入裝有填充劑的色譜柱中，從而分離各組分。該方法應(yīng)用范圍廣，能分析氣體、液體、固體；分離效率高、分析速度快，僅用幾分鐘至幾十分鐘便可完成一次分析；樣品用量少，靈敏度高，可測量痕量物質(zhì)；選擇性高，可分離性能相近的物質(zhì)或混合物，操作簡便，適用于易揮發(fā)性有機(jī)化合物的定性、定量分析。故本實(shí)驗(yàn)參考2015版《中國藥典》中氣相色譜-毛細(xì)管柱法，建立GC-FID內(nèi)標(biāo)法，以期為復(fù)方丹參制劑生產(chǎn)過程中醇沉上清液的乙醇含量的檢測提供借鑒與參考。

1 儀器與試劑

AgiLent 7890B氣相色譜儀；氫火焰離子檢測器；XS205型分析天平（美國MettLer ToLedo公司）；MiLLi-QR型純水儀（美國MiLLipore公司）；UNE200烘箱（德國Memmert公司）。

無水乙醇（99.9%，批號：190415天津市康科德科技有限公司）；正丙醇（99.5%，批號：RO185710上海凜恩科技發(fā)展有限公司）；復(fù)方丹參醇沉上清液（批號：20181102由天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

AgiLent DB-624（30m×0.53mm×3μm）色譜柱；載氣：N2；氣化溫度：200℃；N2載氣流速：4.7mL·min-1；分流比：1∶1；柱溫：起始 40℃，保持 2min，然后以 3℃·min-1升至65℃，再以25℃·min-1的速度升溫至200℃，保持10min；檢測器溫度：220℃；頂空平衡溫度：85℃；平衡時間:20min；進(jìn)樣量：1μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密量取室溫下無水乙醇2mL，置100mL容量瓶中；精密加入室溫下正丙醇（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）2mL，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液1mL，置100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

精密量取5mL對照品溶液，置20mL頂空進(jìn)樣瓶中，密封。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取室溫下復(fù)方丹參醇沉上清液3mL，精密稱定，置100mL容量瓶中；精密加入室溫下正丙醇2mL，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液1mL，置100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

精密量取5mL供試品溶液，置20mL頂空進(jìn)樣瓶中，密封。

2.3 上清液固含量測定

精密量取上清液25mL于蒸發(fā)皿中，平行2份；水浴蒸干，移至烘箱中，在105℃下干燥5h，移至干燥器中，放冷30min，精密稱定，再在上述溫度下干燥1h，放冷，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過20mg為止，根據(jù)減失的重量，計算浸膏含水量/上清液固含量。

2.4 專屬性測試

分別取水、未加內(nèi)標(biāo)物的提取液、內(nèi)標(biāo)溶液、對照品溶液、供試品溶液，按照測定條件進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示提取液對乙醇的測定無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 氣相色譜圖Fig.1 GC chromatograms of extract（A），internal standard solution（B），standard solution（C），and test solution（D）

2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

按照2.2.1項(xiàng)下方法制備對照品溶液，取1μL注入氣相色譜儀測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得對照品溶液中乙醇峰與正丙醇峰面積比值RSD=0.80%，乙醇峰與正丙醇峰分離度均大于2，以乙醇峰計算其理論塔板數(shù)均大于10000，符合2015版《中國藥典》的規(guī)定。

2.6 線性關(guān)系考察

圖2 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ethanol

精密量取室溫下的無水乙醇 1、2、3、5、7mL，分別置于100mL容量瓶中；精密加入室溫下的正丙醇（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）各2mL，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液各1mL，分別置于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。各取1μL注入氣相色譜儀進(jìn)行測定。以乙醇的體積分?jǐn)?shù)（%）作為橫坐標(biāo)（X），乙醇峰面積與正丙醇峰面積的比值（A乙醇/A正丙醇）作為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖2所示，得到 方 程 Y=25.389X+0.023，R2=0.9998， 表 明 在0.00999%～0.06993%范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與乙醇和正丙醇峰面積比值呈良好的線性關(guān)系。

2.7 相對校正因子的測定

按2.2.1項(xiàng)下方法制備對照品溶液，平行兩份，每份對照品溶液進(jìn)樣3次，每次取1μL注入氣相色譜儀，測定乙醇與正丙醇峰面積，按式1計算得平均校正因子f=1.95，RSD=0.40%。

式中 As：內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積；AR：對照品的峰面積；Cs：內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液的濃度；CR：對照品溶液的濃度。

2.8 精密度測試

按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取1μL注入氣相色譜儀測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得乙醇與正丙醇峰面積比值RSD=0.85%，表明本方法精密度較好。

2.9 重復(fù)性測試

按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，各取1μL注入氣相色譜儀測定，計算得乙醇與正丙醇峰面積比值RSD=1.08%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.10 穩(wěn)定性測試

按照2.2項(xiàng)下方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，分別于 0、4、8、12、16、20h 注入氣相色譜儀，測定乙醇和正丙醇峰面積，考察對照品和供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，對照品和供試品溶液在20h內(nèi)，乙醇與正丙醇峰面積比值基本保持穩(wěn)定，RSD=0.64%、1.41%。

2.11 回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取室溫下復(fù)方丹參醇沉上清液1.5mL，置于100mL容量瓶中，平行9份，以精密度項(xiàng)下所得乙醇量，作為對照品加入依據(jù)，使上清液乙醇含量水平分別達(dá)到70%、100%、130%。各含量水平，平行3份，按2.2.2下方法制備供試品溶液，各取1μL注入氣相色譜儀，測定結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果Tab.1 Recovery determination results

表1結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度良好，乙醇回收率為97.39%～102.54%，RSD為0.53%～1.56%。

2.12 樣品測定

取低、中、高乙醇含量的上清液，共計3組，每組樣品平行2份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別取1μL注入氣相色譜儀測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含醇量測量結(jié)果Tab.2 Measurement results of alcohol content in samples

表2結(jié)果表明，樣品平行性良好，平行樣間RAD＜1%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了用正丙醇作內(nèi)標(biāo)物測定復(fù)方丹參制劑醇沉上清液乙醇含量的氣相色譜方法，該方法在0.00999%～0.069930%范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998；加標(biāo)回收率為97.39%～102.54%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為97.39%～102.54%；精密度試驗(yàn)RSD=0.85%；重復(fù)性試驗(yàn)RSD=1.08%。實(shí)驗(yàn)表明，該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，能快速、準(zhǔn)確測定上清液乙醇含量。