王坤，陳奧，馬石楠,3

1湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰 442000；2武漢科技大學(xué)；3十堰市太和醫(yī)院

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要場所，如果代謝出現(xiàn)問題會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)脂肪細(xì)胞堆積。脂肪肝是一種慢性肝臟疾病，以脂滴在肝細(xì)胞中的異常累積為特征，可發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化，甚至演變?yōu)楦伟＾D(zhuǎn)化生長因子β相關(guān)激酶1(TAK1)是一種蛋白激酶，除在炎癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1]，也參與細(xì)胞增殖、分化、生存的調(diào)控[2]。有研究[3]指出，在小鼠脂肪細(xì)胞中特異敲除TAK1可以有效減少肥胖的發(fā)生。TAK1在脂質(zhì)細(xì)胞代謝方面發(fā)揮重要作用，然而其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是PPAR亞型，抑制PPARγ可以減輕由飲食所誘導(dǎo)的肥胖和糖尿病[4]，PPARγ在脂肪肝以及肝臟變性中發(fā)揮重要作用。研究[5～7]顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡DNA分裂因子樣效應(yīng)因子C(CIDEC)在促進(jìn)甘油三酯積累、調(diào)控脂滴融合、抑制甘油三酯分解方面發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)[8]報(bào)道，敲減TAK1能夠減少3T3L-1前脂肪細(xì)胞的脂肪分化，而PPARγ是脂肪細(xì)胞分化過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。因此，在HepG2細(xì)胞脂滴積累的過程中，TAK1很可能通過PPARγ影響肝細(xì)胞的脂滴積累。TAK1抑制劑(NG25)是一種合成的Ⅱ型TAK1抑制劑，可有效抑制TAK1活性[9～11]。靶向TAK1作為一種提高腫瘤治療效果的策略，已經(jīng)在幾種惡性腫瘤中進(jìn)行了研究，但目前關(guān)于NG25對脂滴積累的作用以及其對肝癌潛在治療作用鮮有報(bào)道。2018年10月～2019年11月，我們觀察了NG25對人肝癌細(xì)胞系HepG2脂滴積累的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 HepG2細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞系HEK-293T購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。PPARγ、GAPDH、CIDEC抗體購自美國Abcam公司，NG25 trihydrochloride購自美國Sigma公司。

1.2 NG25處理的HepG2細(xì)胞油紅O染色紅光強(qiáng)度觀察 取HepG2細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2環(huán)境中。將細(xì)胞分為處理組和對照組，處理組細(xì)胞加入2 μmol/L NG25處理24 h，對照組加入等體積DMSO處理24 h，兩組均同時(shí)用終濃度為250 μmol/L脂肪酸(OA、PA各125 μmol/L)共同孵育。采用油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴積累情況：0.5 g干粉溶解到100 mL異丙醇中，37 ℃溫育溶解配制成油紅O原液，油紅O原液與ddH2O以3∶2混合，混合過濾染液靜置10 min后。細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗3次，每次5 min，再使用4%多聚甲酸固定30 min，隨后用混合過濾染液染色10～15 min，PBS洗3次之后可進(jìn)行DAPI復(fù)染后明膠固定，最后用預(yù)冷PBS洗3次并進(jìn)行封片。顯微鏡下進(jìn)行觀察采圖，圖像用Image J軟件分析，以單位面積內(nèi)的紅色光強(qiáng)度表示細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累。

1.3 NG25處理的HepG2細(xì)胞PPARγ mRNA、蛋白及PPARγ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性檢測 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)方法同“1.2”。①PPARγ mRNA：取對數(shù)期生長的的HepG2細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，24孔板每孔加入600 μL的TRIzol試劑，室溫靜置5 min，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入0.2倍體積的氯仿(4 ℃預(yù)冷)，用力振搖15 s，靜置5 min，4 ℃環(huán)境下以12 000 r/min速度離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，加入等體積的異丙醇(4 ℃預(yù)冷)，顛倒混勻，靜置10 min，4 ℃環(huán)境下以12 000 r/min速度離心15 min，棄上清，沉淀用500 μL的75%乙醇(4 ℃預(yù)冷)清洗，4 ℃環(huán)境下以8 000 r/min的速度離心5 min，棄上清，沉淀自然晾干，用適量DEPC水溶解，-80 ℃保存，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T18將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用AlleleID 7軟件與Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物，分別為GAPDH正向引物5′-TGGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，反向引物5′-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3′，PPARγ正向引物5′-CATTCTGGCCCACCAACTTTGG-3′，反向引物5′-TGGAGATGCAGGCTCCACTTTG-3′。定量PCR引物，cDNA模板和SYBR Green mix(Takara)共同配制20 μL反應(yīng)體系在CFX96定量儀器(Bio-Rad)中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，得出各組樣品的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，每組重復(fù)3次，取平均值。②PPARγ蛋白：貼壁的HepG2細(xì)胞收取蛋白樣品時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1次，加入1 mL蛋白裂解液，冰浴15 min，4 ℃環(huán)境下以12 000 g/min的速度離心15 min后取上清備用。用BCA法測定蛋白濃度，并將蛋白濃度調(diào)整一致后再與含有溴酚藍(lán)的上樣緩沖液充分混合后在100 ℃沸水中煮5 min使蛋白變性。按薩姆布魯克方法配制8%分離膠和5%濃縮膠。在電泳裝置加入適量SDS電泳緩沖液，在加樣孔中加入處理好的蛋白樣品，每孔上樣20 μL。接通電源，電壓調(diào)至80 V，待溴酚藍(lán)指示劑跑到分離膠底部時(shí)斷電，結(jié)束電泳。取SDS-PAGE電泳后的凝膠，用轉(zhuǎn)印裝置將蛋白帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，在低溫環(huán)境下，100 V電壓轉(zhuǎn)膜1 h。將膜置于5%的BSA封閉液中封閉8 h，棄去封閉液后，用TBST洗滌3次，每次5 min，加入適當(dāng)稀釋的一抗溶液，4 ℃孵育超過8 h，棄去一抗，TBST洗滌3次，每次5 min，加入適當(dāng)稀釋的二抗溶液，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，TBST洗滌3次，每次5 min。加入配制好的化學(xué)發(fā)光液滴于膜上，待充分反應(yīng)后，用成像系統(tǒng)采圖，用Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。③PPARγ啟動(dòng)子熒光素酶活性：取HEK-293T細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2環(huán)境中。將PPARγ的啟動(dòng)子(2200/ 1)片段構(gòu)建到pGL3-Basic質(zhì)粒上，將HEK-293T細(xì)胞接種于24孔板中培養(yǎng)，每孔加入500 μL細(xì)胞生長培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將1 μg 該重組質(zhì)粒與1 μL脂質(zhì)體分別溶于50 μL Opti-DMEM培養(yǎng)基中，混勻后室溫靜置5 min；將脂質(zhì)體與質(zhì)粒輕柔吹打混勻，總體積為100 μL，室溫靜置20 min；將孔板中細(xì)胞用DMEM無血清培養(yǎng)基清洗，然后加入100 μL質(zhì)?！|(zhì)體復(fù)合物，并加入400 μL的Opti-DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2環(huán)境下；轉(zhuǎn)染6 h后，更換成細(xì)胞生長培養(yǎng)基。將實(shí)驗(yàn)分為2組，分組和干預(yù)方法同“1.2”。熒光素酶活性檢測：HEK-293T細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用1×PBS清洗細(xì)胞，24孔板的每孔加入80 μL的1×Passive Lysis Buffer，用細(xì)胞刮鏟刮下細(xì)胞，冰上靜置30 min。收集樣品至1.5 mL離心管中，以3 000 r/min速度離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中。配制Luciferase Assay BufferⅡ與Stop&Glo試劑，避光放置。取10 μL細(xì)胞裂解樣品置于新離心管中，加入40 μL Luciferase Assay BufferⅡ，輕柔混勻，放入熒光光度計(jì)中，反應(yīng)時(shí)間為5 s，檢測熒光素酶活性，記錄數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)為螢火蟲熒光素酶的活性；將離心管取出，加入40 μL Stop&Glo試劑，輕柔混勻，放入熒光光度計(jì)中，反應(yīng)時(shí)間為5 s，檢測熒光素酶活性，記錄數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)為海腎熒光素酶的活性。將測得的螢火蟲熒光素酶的活性值與相應(yīng)的海腎熒光素酶的活性值的比值作為熒光素酶的相對表達(dá)活力。

1.4 NG25處理的HepG2細(xì)胞CIDEC mRNA、蛋白檢測 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)方法同“1.2”。CIDEC mRNA檢測方法同“1.3中的①”，CIDEC正向引物5′-GCAAGCTGCTCAGGAATAAAG-3′，反向引物5′-GCTGGAGGGCTCAAAATGGT-3′。CIDEC蛋白檢測方法同“1.3中的②”。

1.5 超表達(dá)PPARγ的HepG2細(xì)胞CIDEC mRNA、蛋白檢測 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)同“1.2”。實(shí)驗(yàn)共分為3組?；謴?fù)組：HepG2細(xì)胞預(yù)先轉(zhuǎn)染1 μg質(zhì)粒PPARγ后再加入2 μmol/L NG25處理24 h，轉(zhuǎn)染步驟見“1.3中的③”；處理組：HepG2細(xì)胞加入2 μmol/L NG25處理24 h；對照組：HepG2細(xì)胞加入等體積DMSO處理24 h。3組均同時(shí)用終濃度250 μmol/L脂肪酸(OA、PA各125 μmol/L)共同孵育。CIDEC mRNA相對表達(dá)量的檢測方法同“1.3中的①”，CIDEC蛋白相對表達(dá)量的檢測方法同“1.3中的②”。

2 結(jié)果

2.1 處理組和對照組油紅O染色紅光強(qiáng)度比較 處理組及對照組油紅O染色紅光強(qiáng)度分別為154±10、202±12，兩組比較，P<0.05。

2.2 處理組和對照組PPARγ mRNA、蛋白相對表達(dá)量及PPARγ啟動(dòng)子熒光素酶活性比較 處理組和對照組PPARγ mRNA、蛋白相對表達(dá)量及PPARγ啟動(dòng)子熒光素酶活性比較見表1。

表1 處理組和對照組PPARγ mRNA、蛋白相對表達(dá)量及PPARγ啟動(dòng)子熒光素酶活性比較

2.3 處理組和對照組CIDEC mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較 處理組和對照組CIDEC mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較見表2。

表2 處理組和對照組CIDEC mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較

2.4 恢復(fù)組、處理組、對照組CIDEC mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較 恢復(fù)組、處理組、對照組CIDEC mRNA和蛋白相對表達(dá)量比見表3。

表3 恢復(fù)組、處理組、對照組CIDEC mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

脂滴是細(xì)胞內(nèi)中性脂的主要貯存場所，脂滴異常積累引起會(huì)肥胖、脂肪肝、心血管疾病、糖尿病、中性脂貯存性疾病等諸多代謝病變，而非酒精性脂肪肝是其中最為常見的一種。目前，非酒精性脂肪肝的治療手段主要是控制飲食，控制體質(zhì)量和增加運(yùn)動(dòng)。非酒精性脂肪肝病開始于肝臟甘油三酯的過度積累，而且非酒精性脂肪肝病患者肝臟通過募集并活化巨噬細(xì)胞分泌IL1β、IL18、IL12、TNF-α和CCL2、CCL5等炎癥因子，導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化的發(fā)生，從而進(jìn)一步促進(jìn)肝癌的形成[12]。研究顯示，TAK1在脂肪肝和脂肪肝炎的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)[13]報(bào)道，E3連接酶TRIM8可以通過引起TAK1的泛素化，進(jìn)而促進(jìn)TAK1的磷酸化，從而促進(jìn)由高脂飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生的脂肪肝以及脂肪肝炎。TAK1的激活可以顯著的促進(jìn)非酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展[14]?；谝陨涎芯砍晒覀兺茰y通過抑制TAK1的活性可以抑制脂滴的積累，從而起到阻遏肝病的作用。

NG25是一種新型的TAK1抑制劑，可以有效抑制TAK1活性。研究[15,16]表明，NG25可作為乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤的潛在治療策略，但關(guān)于NG25對脂滴積累和對肝癌等相關(guān)疾病的治療效果的作用還沒有相關(guān)報(bào)道。本研究為了探索NG25對HepG2細(xì)胞中脂滴積累的影響，我們將處理組和對照組細(xì)胞用油紅O進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示NG25能夠顯著降低細(xì)胞中的脂滴積累，提示NG25對HepG2細(xì)胞脂滴積累有抑制作用。

據(jù)報(bào)道，肥胖小鼠PPARγ表達(dá)量顯著上調(diào)[17]，而ob/ob小鼠中特異的抑制PPARγ的表達(dá)可以改善脂肪肝[18]。CIDEC定位于脂滴表面，其能夠通過促進(jìn)單室大脂滴形成增加脂滴積累[19]。為了研究NG25在HepG2細(xì)胞中是否通過PPARγ和CIDEC來影響肝細(xì)胞的脂滴積累，我們檢測了細(xì)胞PPARγ和CIDEC mRNA、蛋白，結(jié)果顯示與對照組相比，處理組細(xì)胞PPARγ和CIDEC mRNA、蛋白相對表達(dá)量均下調(diào)，且通過抑制TAK1的活性能夠降低PPARγ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。有研究表明，在3T3L-1細(xì)胞中PPARγ能夠作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)CIDEC啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，而我們前期數(shù)據(jù)顯示抑制TAK1活性能同時(shí)下調(diào)PPARγ和CIDEC的表達(dá)，我們推測在HepG2細(xì)胞中TAK1抑制劑可能通過PPARγ調(diào)控CIDEC的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測，我們收集3組細(xì)胞RNA和蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示超表達(dá)PPARγ能夠有效的逆轉(zhuǎn)由NG25處理引起的CIDEC的基因和蛋白水平的下調(diào)。這表明在HepG2細(xì)胞中，NG25通過PPARγ調(diào)控CIDEC的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)肝脂積累，即NG25調(diào)節(jié)肝臟脂滴積累的分子機(jī)制是NG25通過PPARγ-CIDEC信號(hào)通路來抑制肝臟脂滴的積累。

總之，NG25對HepG2細(xì)胞脂滴積累有抑制作用，機(jī)制可能是抑制PPARγ的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)CIDEC表達(dá)，即通過PPARγ-CIDEC信號(hào)途徑最終抑制HepG2細(xì)胞脂滴積累。