張佳,李永軍,屈玲玲,毛孫炳,李蘭娟

(浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院,傳染病診治國家重點實驗室,無菌實驗動物平臺,杭州 310003)

無菌大鼠,是指體內(nèi)不存在任何包括細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲、支原體、衣原體、螺旋體、立克次體在內(nèi)的活的生命體的動物,這種動物模型為研究和驗證腸道微生態(tài)和宿主正常生理的相互關(guān)系提供了行之有效的方法。

在國內(nèi)無菌大鼠以個別機(jī)構(gòu)少量生產(chǎn)后自用為主,國內(nèi)尚無無菌大鼠規(guī)?；嘤晒皯?yīng)用的報道。 這導(dǎo)致了無菌大鼠大多是從國外引進(jìn)。 目前,國際上主要有兩家專業(yè)機(jī)構(gòu)提供無菌大鼠模型,但其費用昂貴、運(yùn)輸不便、維持困難[1]。

無菌大鼠在培育過程中,由于腸道菌群的缺失,乳鼠在喂奶后往往出現(xiàn)消化不良,吸收障礙,腹瀉、腹部脹氣進(jìn)而腹部發(fā)黑,相繼死亡,這一過程是造成無菌大鼠培育失敗的主要原因之一。 配方奶中蛋白質(zhì)為大分子顆粒,對于幼鼠的吸收很困難,在胃腸微生物缺失的環(huán)境下,更易出現(xiàn)各種消化問題。 另外在腸道中,由于乳糖酶的缺少會產(chǎn)生乳糖不耐,進(jìn)而產(chǎn)氣。 深度水解蛋白無乳糖奶粉不僅不含乳糖,而且蛋白分子被深度水解為小分子蛋白,在人類嬰幼兒的哺乳中被使用,增加嬰幼兒營養(yǎng)的吸收,減少乳糖不耐癥的發(fā)生,促進(jìn)生長發(fā)育[2]。無菌大鼠的培養(yǎng)中,使用深度水解蛋白的無乳糖奶粉是否會提高培育無菌大鼠的成活率,目前尚無文獻(xiàn)報道,本實驗將通過使用深度水解蛋白的無乳糖奶粉和普通全價奶粉的使用,觀察是否在培育無菌大鼠中對乳鼠生存率有影響,進(jìn)一步促進(jìn)無菌大鼠的培育工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

10 只清潔級的 SD 大鼠,390 ～ 420 g,孕期20 d,購于浙江省實驗動物中心【SCXK(浙)2019-0002】。40 只即將臨產(chǎn)的普通級新西蘭白兔,4.2 ～4.9 kg,由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供【SCXK(浙)2017-0001】。動物實驗在浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院無菌動物實驗室進(jìn)行【SYXK(浙)2019-0012】,經(jīng)醫(yī)院實驗動物中心倫理委員會審批(2018 實動快審749 號)。 無菌大鼠隔離器內(nèi)的溫度為33 ～34℃,12 h/12 h 晝夜交替,相對濕度60% ～70%,所有操作均符合實驗動物福利和倫理委員會的要求。

1.1.2 試劑與儀器

小牛血清購于Gibco 公司,嬰幼兒奶粉對照組為普通嬰兒奶粉,品牌為惠氏愛兒樂(S-26),實驗組為深度水解蛋白的無乳糖奶粉,品牌為雀巢藹兒舒。 腦心浸液培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉鹽培養(yǎng)基購于美國BD 公司,胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基購于海博生物公司。 兔乳為本實驗室自制：臨產(chǎn)母兔至產(chǎn)仔后第20 天,每日人工擠奶收集,混合后測量乳糖含量,調(diào)整乳糖濃度為25 g/L 后用來配制。 軟塑隔離器、空氣過濾器、傳遞罐和滅菌筒購于馮氏實驗動物設(shè)備有限公司。 無菌大鼠血生化指標(biāo)的分析儀器為深圳藍(lán)韻醫(yī)療器材公司的全自動生化分析儀LW C400。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠子宮摘除

使用清潔級的SD 大鼠,選擇懷孕時間已經(jīng)為20 d 的未生產(chǎn)母鼠,分別用推算法、觸診法、觀察法和綜合法進(jìn)行判斷,預(yù)測并確定孕鼠最終生產(chǎn)的時間點。 將預(yù)測生產(chǎn)時間點和實際生產(chǎn)時間點進(jìn)行比較,兩者相差1 h 以內(nèi)的結(jié)果認(rèn)定為判斷準(zhǔn)確。

CO2麻醉后,用剪刀沿腹中線剪開皮膚,剪開腹肌,露出子宮。 用手將子宮托起,用止血鉗將子宮頸和兩側(cè)輸卵管夾住,沿止血鉗子宮遠(yuǎn)程端宮頸和輸卵管剪斷。 離體子宮放入傳送袋中,經(jīng)滅菌渡槽(內(nèi)裝37℃的2%過氧乙酸),轉(zhuǎn)入手術(shù)隔離器。 在手術(shù)隔離器內(nèi),用 0.1 mol/L 氫氧化鈉中和子宮表面的過氧乙酸后,用兩把組織鑷將子宮及羊膜撕開。 擠出胎鼠,撩去口鼻處羊水,用鑷子輕輕夾捏胎鼠的尾巴,刺激其呼吸。 然后剪斷臍帶,2 h 后開始人工哺乳。

1.2.2 人工乳的配制

在配制無菌大鼠人工乳的方面,為了減少其他營養(yǎng)因子的干擾,參考了文獻(xiàn)報導(dǎo)中的配方[3],進(jìn)行簡化后配制,對照組的配方見表1,實驗組配方為將對照組中的普通嬰幼兒奶粉替換為無乳糖深度水解奶粉,配制好以后60Co 輻照消毒。 根據(jù)計算三個階段的乳糖含量：實驗組為13.5 g/L、14.75 g/L和 16.25 g/L,對照組為 17.95 g/L、19.74 g/L 和21.24 g/L。

表1 無菌大鼠配方乳配料表Table 1 Ingredients of germ-free rat formula milk

1.2.3 乳鼠人工哺乳

根據(jù)乳鼠日齡的不同選用適宜的人工乳和吮吸乳頭,連接好人工哺乳裝置,將人工乳充滿整個注射器、連接硅膠管和吸吮的人工乳頭中,左手拇指和食指固定乳鼠頭部,另外三個手指輕輕捏住動物,右手拇指和食指夾持人工乳頭近乳頭端一厘米處,擠出一滴乳誘導(dǎo)其張開嘴巴,然后將乳頭插入乳鼠口中,放在舌頭之上。 這時用右手的拇指和食指輕輕堵在乳鼠口部。 觀察注射器內(nèi)的液面變化情況。 如果出現(xiàn)液面下降,說明乳鼠開始吸吮。 哺乳到第22 天離乳自由舔食,每日稱量體重,計數(shù)死亡數(shù)和腹黑數(shù)。

1.2.4 無菌檢測

在隔離器內(nèi)收集無菌大鼠糞便、飼料、墊料、飲用水、棉拭子(皮毛、水瓶嘴、隔離器通風(fēng)口、隔離器內(nèi)壁)于無菌試管中,無菌操作下從隔離器內(nèi)取出。糞便標(biāo)本中加入適量無菌雙蒸水制成糞便懸液,棉拭子標(biāo)本中加入少量無菌雙蒸水(以沒過樣品為宜),用吸管充分混勻。

在無菌操作臺分別取0.5 mL 樣品溶液接種于已配置好的腦心浸液培養(yǎng)基、硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基、胰酪大豆胨培養(yǎng)基內(nèi),并各自設(shè)置陰、陽性對照,陽性對照樣品為SPF 大鼠糞便。 接種后將硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng),胰酪大豆胨培養(yǎng)基置于26℃培養(yǎng)。 培養(yǎng)14 d,逐日觀察有無細(xì)菌或真菌生長。 在培養(yǎng)第7 天和第14 天,從37℃培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)種相應(yīng)的血培養(yǎng)基平板,再于37℃培養(yǎng)4 d,觀察平板上有無細(xì)菌或真菌生長。

1.2.5 無菌大鼠血生化指標(biāo)

8 W 的無菌大鼠雌雄各3 只,麻醉后采血,室溫放置30 min,3000 r/min 離心 30 min 分離血清。 測試指標(biāo)有：ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、ALB(白蛋白)、BUN(血尿素氮)、CR(血肌酐)、TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)和GLU(葡萄糖)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx ± s)來表示,采用t 檢驗,以P＜0.05 為差異具有顯著性,P ＜0.01 差異極具有顯著性。 運(yùn)用卡方檢驗對兩種人工配置乳的飼養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行計算。

2 結(jié)果

2.1 無菌大鼠模型的建立

共培養(yǎng)10 個批次的無菌大鼠,其中對照組4 個批次,起始培養(yǎng)數(shù)為45 只,22 d 離乳存活數(shù)為8 只。實驗組為6 個批次,起始培養(yǎng)數(shù)為78 只,22 d 離乳存活數(shù)為29 只。 無菌檢測結(jié)果均為陰性。

2.2 無菌大鼠的生長曲線

使用添加兩種不同奶粉的配方奶飼養(yǎng)的無菌大鼠,其體重變化見圖1,在出生后的1 ～7 d 體重呈現(xiàn)下降的趨勢,從第7 天開始,無菌大鼠的體重開始增加,直至第14 天,體重增幅達(dá)到相同;從第14天開始體重增幅變化趨勢發(fā)生變化,使用深度水解蛋白低乳糖奶粉的實驗組,體重的增幅明顯高于了使用全價奶粉的對照組。

2.3 死亡無菌大鼠的腹黑率

對2 組哺乳無菌大鼠的腹黑率進(jìn)行統(tǒng)計,對照組共死亡 37 只,其中 35 只發(fā)生腹黑,比例為94.59%;實驗組共死亡49 只,40 只發(fā)生了腹黑的現(xiàn)象,腹黑率為81.63%,對比可見實驗組的腹黑率低于對照組(81.63% vs 94.59%)。

圖1 無菌大鼠的生長曲線Figure 1 Growth curve of germ-free rats

2.4 無菌大鼠的體重對比

如圖2 所示,選取了0,14 和22 d 的體重進(jìn)行比較。 第 0 天(5.76 ± 0.08)vs(5.83 ± 0.08)和第14 天的體重(7.3 ± 0.36)vs(7.89 ± 0.16)均無顯著的差異,第22 天實驗組的體重顯著高于對照組(9.96 ± 0.49)vs (13.36 ± 0.59),差異極具有顯著性(P＜0.01)。

2.5 無菌大鼠的生存曲線

根據(jù)生長曲線和體重的分析對比發(fā)現(xiàn),在14 d左右飼養(yǎng)的無菌大鼠的生理數(shù)據(jù)出現(xiàn)了差別,所以生存曲線被分為0 ～14 d 和14 ～22 d 分別計算。由圖3A 所示,在培養(yǎng)的前14 d,實驗組和對照組的生存率無差別(P=0.82)。 圖3B 顯示實驗組在第14 ～ 22 天的生存率差異極具有顯著性(P =0.0002),實驗組的生存率極顯著高于對照組。

注：與對照組相比,** P ＜0.01。圖2 無菌大鼠的體重對比Note. Compared with control group,** P ＜0.01.Figure 2 Weight comparison of germ-free rats

2.6 對兩組無菌大鼠的卡方檢驗

將兩組無菌大鼠實驗數(shù)據(jù)做成表2 的分類統(tǒng)計表格,假設(shè)H0：無菌大鼠的存活率與配方奶中添加何種奶粉無關(guān),即二因子相互獨立。 HA：無菌大鼠的存活率與配方奶中添加何種奶粉有關(guān),即二因子彼此相關(guān)。 統(tǒng)計推斷結(jié)果為χ2=4.24 ＞χ20.05=3.84,P＜0.05,否定H0接受HA。 說明無菌大鼠的存活率和添加奶粉的類型顯著相關(guān)。

2.7 無菌大鼠血生化指標(biāo)檢測結(jié)果

由表3 所示,雌雄無菌大鼠的 BUN(血尿素氮)、TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)表現(xiàn)為差異顯著。 其余5 項ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、ALB(白蛋白)、CR(血肌酐)、GLU(葡萄糖)雌雄間差異無顯著性。

注：A：0 ～ 14 d 的生存曲線;B：14 ～ 22 d 的生存曲線。圖3 無菌大鼠的生存曲線Note. A, the survival curve of 0 -14 days. B, the survival curve of 14 - 22 days.Figure 3 Survival curve of germ-free rats

表2 實驗組和對照組22 d 存活率的分類統(tǒng)計表(內(nèi)為理論數(shù)值)Table 2 Classified statistics of 22-day survival rates in the two groups(The numbers in parentheses are theoretical values)

表3 無菌大鼠血生化指標(biāo)結(jié)果Table 3 Results of blood biochemical indexes of germ-free rats

3 討論

無菌動物是非常好的研究模型,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)腸道菌群的失衡與糖尿病、感染性疾病、炎癥性腸病、肝病,甚至腦部疾病等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-8]。而無菌大鼠的成功培育非常困難,其技術(shù)要求高(人工哺乳技術(shù))、需要特殊環(huán)境、專門儀器(隔離器)、 成本高、 污染率高、 成功率低。 1945 年,Reyniers 報道無菌大鼠繁殖成功后,其他研究者對無菌大鼠的培育也曾反復(fù)進(jìn)行研究,但研究方法比較繁瑣,甚至還有保守的成分存在,報道內(nèi)容不盡詳細(xì),都使得無菌大鼠的培育受到制約[1,3,9-13]。

在無菌大鼠的培養(yǎng)過程中,從出生人工喂養(yǎng)到斷奶,這一過程無疑是最重要的環(huán)節(jié),只要度過這個時期,就會為后面的成年無菌大鼠飼喂和種群擴(kuò)繁提供可靠的保障。 而人工喂養(yǎng)的乳鼠,由于在無菌的環(huán)境下,沒有腸道菌群的參與和人工配制乳配方的缺陷,往往到斷奶時有很高的死亡率。

無菌大鼠配方奶中的動物乳中含有一種或多種蛋白,可以引發(fā)胃腸道和呼吸道的不良過敏反應(yīng),深度水解牛乳蛋白奶粉通過超高溫加熱和酶切等技術(shù)的加工,將牛乳中蛋白質(zhì)分子變小,或成為多肽、氨基酸,使其不含食物蛋白以減少動物乳蛋白的致敏性,降低發(fā)生牛乳蛋白過敏的概率[2]。 另外,非水解奶粉平均粒徑大,消化過程復(fù)雜,在胃中消化時會產(chǎn)生脂滴聚集的現(xiàn)象,消化不徹底,而深度水解的乳蛋白奶粉可以避免或減少這些情況,消化的更為快速,因此深度水解的配方奶粉對于動物的生長有顯著的促進(jìn)作用。 這兩項重要因素與無菌大鼠飼養(yǎng)培育實驗的結(jié)果相符合,實驗組在后期顯著提高了無菌大鼠的體重和存活率。

由于無菌大鼠飼養(yǎng)的環(huán)境中不存在微生物,造就了自身特殊的生理條件,比如成年無菌大鼠的消化系統(tǒng)中,麥芽糖酶、蔗糖酶、海藻糖酶、纖維二糖酶和乳糖酶的活性大大高于普通飼養(yǎng)條件中的大鼠。 另外,無菌大鼠出生前,乳糖酶的活性便開始增加,出生時的活性就為無菌成年大鼠的2.6 倍左右,在出生后的第7 天左右達(dá)到最高點,約為無菌成年大鼠的4 倍,隨即下降,20 d 左右降低到平臺期保持不變,纖維二糖酶也有著相似的變化曲線[14-15]。

這些無菌大鼠的生理特點與實驗中的生理數(shù)據(jù)變化相呼應(yīng),培養(yǎng)的無菌大鼠在離乳人工飼喂的前7 d,兩組實驗的無菌大鼠都呈現(xiàn)出體重不增反降,可能是人工飼喂的應(yīng)激期,待習(xí)慣了這種飼喂方式,體重開始增加。 持續(xù)到第14 天,體重的增加和生存率都沒有差別。 從第14 天開始,飼喂深度水解的無乳糖奶粉實驗組的體重增幅明顯高于對照全價奶粉組,而死亡率低于實驗組。 由于實驗組中添加了不含乳糖的奶粉,使得實驗組中的乳糖含量低于對照組,而乳糖酶的活性在第14 天下降到的水平成為了拐點,使得對照組不能充分利用吸收的乳糖開始增加,滲透壓增高,造成一系列的乳糖不耐和消化不良反應(yīng),從而降低了體重的增速,增加了死亡率。

在無菌大鼠飼喂的配方奶方面,根據(jù)查到的文獻(xiàn)都比較復(fù)雜繁瑣,本研究中簡化了相關(guān)配方,雖然兔乳在配方中超過了總量的50%,嬰兒奶粉只是作為補(bǔ)充的添加,但是即便如此,使用深度水解無乳糖奶粉的實驗組還是在生存率和體重增速上優(yōu)于實驗組,說明深度水解無乳糖的奶粉在無菌大鼠的培育中確實起到了促進(jìn)作用,下一步的工作中,繼續(xù)增加這種奶粉的比重,是否會更進(jìn)一步提高無菌大鼠繁育的成活率還有待進(jìn)一步的研究。

無菌大鼠的血生化分析中,可以看到,由于在無菌環(huán)境下生長,大鼠的生化指標(biāo)有所變化,相比較于清潔級的大鼠[16],AST(天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)降低,GLU(葡萄糖)升高。 在性別分組的比較上,有三項表現(xiàn)為差異具有顯著性,分別是BUN(血尿素氮)、TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯),根據(jù)結(jié)果分析, BUN(6.19 ± 0.21)mmol/L vs(6.99 ± 0.42)mmol/L 和 TC(2.22 ± 0.15) mmol/L vs(2.84 ±0.23)mmol/L 的差異擴(kuò)大樣本量后可以消除,但是TG(0.55 ± 0.11)mmol/L vs(1.44 ± 0.48)mmol/L結(jié)果的表現(xiàn)為雄性顯著低于雌性,結(jié)合雌性無菌大鼠血糖也顯著升高,在無菌環(huán)境下,雌性無菌大鼠的生理生化指標(biāo)受到的影響較大,這種差別是否是由于雌性對無菌環(huán)境更為敏感造成的,具體機(jī)制還需實驗證實。