王崢,李秀敏,苗晉鑫*

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué),中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450000; 2. 紐約醫(yī)學(xué)院,微生物與免疫學(xué)系,耳鼻喉系,紐約10595)

食物過敏(Food allergy, FA)是世界第五大公共衛(wèi)生問題,其臨床特征為口腔粘膜、喉嚨、胃腸道等組織或器官局部炎癥,常伴有皮膚反應(yīng),嚴(yán)重時可危及生命[1]。 食物過敏因其反應(yīng)的嚴(yán)重程度及終身性引起了人們廣泛的關(guān)注[2]。 研究FA 發(fā)病機(jī)制、防治手段對改善食物過敏患者病情至關(guān)重要。目前,仍缺乏完全模擬人類食物過敏臨床特征的動物模型。 不同動物模型對同一食物過敏原識別模式和過敏的敏感性存在差異,在蛋白質(zhì)致敏研究中,豬和狗的食物過敏模型具有與人類非常相似的過敏反應(yīng),但是致敏周期長,致敏劑量大和價格昂貴,且缺乏相關(guān)的分子免疫試劑,因此它們更多是用于過敏機(jī)制研究而非致敏性評價。 食物過敏小鼠模型體積小,易于繁殖和價格便宜,并有多種小鼠免疫分子試劑及近親交配和轉(zhuǎn)基因小鼠,已廣泛用于各種IgE 介導(dǎo)的過敏性疾病的分子和細(xì)胞機(jī)制研究。 FA 小鼠模型為研究食物過敏原致敏性發(fā)生、發(fā)展和治療食物過敏的基本工具[3-4]。 FA 小鼠模型分為依賴佐劑模型、無佐劑模型、轉(zhuǎn)基因模型和人源化模型。 然而,尚無小鼠模型模擬全部人類FA疾病的病理學(xué)特征,使用特定的食物過敏小鼠模型對解決特定食物過敏研究問題至關(guān)重要。 本綜述旨在總結(jié)不同F(xiàn)A 小鼠模型與人FA 疾病的相似性以及應(yīng)用范圍,為食物過敏性疾病的研究提供理論及科學(xué)基礎(chǔ)。

1 佐劑輔助致敏小鼠模型

小鼠免疫系統(tǒng)是目前研究體內(nèi)復(fù)雜的免疫反應(yīng)的絕佳模型[5]。 已開發(fā)多種特定IgE 產(chǎn)生的過敏小鼠模型,過敏原口服途徑是食物過敏小鼠模型常用制備方法[6]。 但是,口服途徑對誘導(dǎo)IgE 的敏感性較低。 佐劑輔助致敏可增強(qiáng)免疫激活作用,導(dǎo)致非過敏性蛋白誘導(dǎo)Th2 反應(yīng),有助于FA 小鼠模型的成功建立[7]。 本文主要闡述4 種常用的佐劑致敏物,氫氧化鋁、霍亂毒素(cholera toxin,CT)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)。

1.1 氫氧化鋁輔助致敏

氫氧化鋁是經(jīng)典的免疫激活劑。 研究發(fā)現(xiàn)通過對BALB/c 小鼠皮下注射1 mg 氫氧化鋁佐劑與100 μg 花生粗提蛋白(crude peanut extract protein,CPE),共注射兩次,間隔時間為3 周,第二次免疫1周后,皮下注射200 μg CPE 進(jìn)行激發(fā),成功獲得致敏小鼠模型。 結(jié)果,該致敏小鼠出現(xiàn)與人類相似的臨床癥狀,腹瀉、精神萎靡、撓頭搔耳、呼吸急促,肺泡灌洗液中肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量都顯著升高和血清中IgE 表達(dá)上升[8]。 研究提示,該模型采用去除脂肪和多糖類物質(zhì)中的花生粗蛋白對小鼠進(jìn)行致敏,其致敏性強(qiáng),能反映花生作為食品引起的過敏反應(yīng)。 氫氧化鋁佐劑價格便宜和購買方便,但其配制方法繁瑣, 對pH 值范圍要求較高。 值得注意的是采用皮下致敏途徑,因佐劑的吸收速度較慢會在注射部位引起較嚴(yán)重的局部反應(yīng),導(dǎo)致皮下注射后易形成腫塊[9]。

1.2 CT 輔助致敏

Song 等[10]采用 CT 和花生對 C3H/HeJ 小鼠灌胃,結(jié)果出現(xiàn)腹瀉、體溫下降及血漿中組胺、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增加的過敏癥狀。 利用FAHF-2 藥物對CT 輔助致敏的小鼠治療,小鼠體溫恢復(fù)正常、外周血中的組胺表達(dá)量和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少[10]。

1.3 LPS 輔助致敏

Rodriguez 等[11]在第 0、7、14、21、28 和 35 天對BALB/c 小鼠進(jìn)行桃蛋白prup 3 和LPS 腹腔注射,結(jié)果小鼠出現(xiàn)體溫下降、呆滯、呼吸頻率增加、IgE抗體水平升高等全身的過敏反應(yīng)特征。 Th1/Th2 向Th2 偏移是產(chǎn)生過敏的關(guān)鍵因素,食物過敏時Th2型細(xì)胞活化增加,IL-4 的生成顯著增多, 進(jìn)而誘導(dǎo)B 細(xì)胞生成大量sIgE, 并誘發(fā)機(jī)體發(fā)生過敏性炎癥反應(yīng)[12]。 研究發(fā)現(xiàn),佐劑可以增強(qiáng)某些蛋白質(zhì)誘導(dǎo)Th2 反應(yīng)作用,根據(jù)LPS 濃度調(diào)節(jié)反應(yīng)趨向于Th1模式或增強(qiáng)Th2 反應(yīng)的誘導(dǎo)[11,13-15]。

1.4 SEB 輔助致敏

SEB 與抗原一起使用可導(dǎo)致系統(tǒng)免疫反應(yīng)。Ganeshan 等[16]每周1 次對小鼠灌胃100 mg 卵清蛋白(ovalbumin, OVA)和10 mg SEB,最終劑量為100 mL,持續(xù) 8 周,在第 9 周后,5 mg OVA 灌胃攻擊,成功建立SEB 輔助OVA 致敏小鼠模型。 該小鼠模型血清中IgE、組胺水平升高,嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增加、空腸組織出現(xiàn)水腫等臨床過敏癥狀。 SEB 輔助致敏相對于CT 輔助致敏能促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的增加,并且可通過降低劑量來促進(jìn)花生的過敏反應(yīng)[17]。

2 無佐劑小鼠模型

關(guān)于食物過敏原的性質(zhì)以及造成患者缺乏或喪失耐受性的機(jī)制信息仍然不足,因此研究人員對無佐劑致敏小鼠模型進(jìn)行了深入研究。 費巧玲等[18]采用含有OVA 的紗布貼于小鼠背部脫毛皮膚處,經(jīng)皮膚成功建立小鼠腸道過敏模型。 無佐劑經(jīng)皮致敏建立的小鼠模型不僅能增加過敏原特異性IgE 抗體的產(chǎn)生還能誘導(dǎo)腸道病理改變。 小鼠腸道過敏模型表現(xiàn)為直腸溫度下降、空腸毛細(xì)血管炎性滲透、腸黏膜出現(xiàn)輕度糜爛,固有層可見較多肥大細(xì)胞聚集、伴隨胞膜破裂、腸絨毛損傷,排列紊亂、斷裂或缺失。 除了通過皮膚致敏還有無佐劑口服增敏方法,首先采用不含佐劑的80 mg 花生灌胃C3H/HeJ 小鼠,兩周后腹腔注射30 mg 花生提取物腹腔注射,小鼠過敏反應(yīng)表現(xiàn)為體溫下降、血清中肥大細(xì)胞蛋白酶-1(Mast cell protease 1,Mmcp1)和花生特異性IgE 表達(dá)升高。 該模型提供了量化且客觀的花生致敏指標(biāo),還原了人類食物過敏的方式,因為他們不需要用佐劑來塑造對食物的過敏性免疫反應(yīng)[19]。

3 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

隨著科學(xué)研究的深入,基因?qū)W改變了我們對包括過敏疾病在內(nèi)的大多數(shù)生物學(xué)領(lǐng)域的理解。 轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)有助于全面認(rèn)識疾病的本質(zhì)特點,并且逐漸成為研究人類疾病的發(fā)展規(guī)律和疾病防治機(jī)理的重要工具之一[20-21]。 本文主要探討Was基因敲除小鼠、Il4rαF709 小鼠和CNS1 基因敲除小鼠三種基因工程小鼠。

3.1 Was 基因敲除小鼠

Snapper 等[22]建立了Was 基因敲除小鼠模型,并發(fā)現(xiàn)Was 基因敲除小鼠與Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein,WASP)缺陷的患者在輕度血小板減少、淋巴細(xì)胞減少、缺陷性T細(xì)胞活化、腸道固有層炎性細(xì)胞浸潤、結(jié)腸隱窩囊腫等方面具有相同特征。 Lexmond 等[23]在特定食物致敏的不同背景下檢測Was-/-小鼠血清中IgE,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在BALB/c 和C57BL/6 背景下的動物對結(jié)腸炎具有抗性,表明結(jié)腸炎癥不會引起對攝入抗原的致敏。 多敏化是人類食物過敏的標(biāo)志,可將WASP 缺陷型小鼠模型來定義潛在的多敏化機(jī)制。因此,條件刪除FOXP3 + Treg 中的Was 導(dǎo)致Th2 型腸道炎癥的食物過敏反應(yīng)程度加重,相比于整體WASP 缺乏小鼠模型更顯著,與臨床癥狀相似[24],為研究T 細(xì)胞活化缺陷的過敏反應(yīng)提供良好的動物模型。

3.2 Il4rαF709 小鼠

IL-4 和 IL-13 通過 IL-4 受體 α 鏈(IL-4Rα)在過敏性疾病中起關(guān)鍵作用。 通過采用苯丙氨酸替換709 位的酪氨酸殘基,誘變 IL-4Rα 的抑制性ITIM 基序失活建立 Il4rαF709 小鼠[25]。 該模型破壞Treg 的功能,促進(jìn)Treg 細(xì)胞向Th2 分化及細(xì)胞因子IL-4 的表達(dá),形成Th2 介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。 經(jīng)OVA致敏的Il4rαF709 小鼠出現(xiàn)過敏相關(guān)的臨床癥狀,針對OVA 特異性IgE 增加,出現(xiàn)局部或全身性Th2介導(dǎo)過敏反應(yīng)以及體溫下降、腹瀉等[26-27]。 病理組織觀察發(fā)現(xiàn)該小鼠的小腸肥大細(xì)胞增殖和絨毛增生。 Il4rαF709 小鼠腸絨毛中粘膜肥大細(xì)胞數(shù)量較多,這個位置有利于與吸收食物蛋白相互作用,支持腸道肥大細(xì)胞擴(kuò)增并驅(qū)動IgE 依賴性過敏反應(yīng)。

3.3 CNS1 基因敲除小鼠

粘膜界面的促炎和消炎機(jī)制之間的平衡與防止過敏、哮喘和腸道炎癥相關(guān)的不良反應(yīng)密切相關(guān)[28]。 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可防止粘膜界面特異性自身免疫和炎性病變。 CNS1 基因敲除小鼠通過破壞Treg 分化和功能促進(jìn)對食物過敏原的致敏作用。非編碼DNA 序列1(CNS1)在腸道相關(guān)淋巴組織中誘導(dǎo)Treg 的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。 CNS1 基因敲除小鼠由于腸道抗原特異性Treg 細(xì)胞的缺乏,胃腸道的免疫平衡可能受到損害。 因此表現(xiàn)出體重下降、IL-4 表達(dá)增加,出現(xiàn) Th2 型過敏反應(yīng)[29-30]。 其中,CNS1 缺陷小鼠的血清抗體對小腸、大腸、胰腺與食物抗原具有反應(yīng)性,整個胃腸道出現(xiàn)了不同程度的病變,如隱窩膿腫、胃炎、漿細(xì)胞腸炎等。

4 人源化食物過敏小鼠模型

人源化小鼠重建了人源免疫系統(tǒng),能夠更好的模擬人體免疫微環(huán)境,是研究免疫發(fā)病機(jī)制和疫苗開發(fā)的理想動物模型[31-33]。 人源化小鼠模型為食物過敏疾病提供可靠的醫(yī)學(xué)研究。 本文介紹常用于食物過敏疾病的人源化小鼠模型,人胸腺植入NSG-SCF/GM-CSF/IL3 小鼠模型、肝和造血干細(xì)胞模型、人類免疫細(xì)胞或干細(xì)胞植入NOD-sciD-γ-/-小鼠和表達(dá)人免疫球蛋白E 受體(FcεRI)小鼠模型,研究食物過敏在人體內(nèi)免疫機(jī)制。

4.1 人胸腺、肝和造血干細(xì)胞植入NSG-SCF/GMCSF/IL3 小鼠模型

研究發(fā)現(xiàn),將人胸腺、肝和造血干細(xì)胞植入NSG-SCF/GM-CSF/IL3 小鼠后,人源化小鼠中人肥大細(xì)胞發(fā)育并產(chǎn)生于腹膜腔和周圍組織,并啟動具有包含人恒定區(qū)嵌合的IgE 導(dǎo)致小鼠被動皮膚過敏反應(yīng)(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)及被動全身性過敏反應(yīng)(passive systemic anaphylaxis, PSA),用于研究人類 IgE 依賴性過敏反應(yīng)[34]。 對 NSGSCF/GM-CSF/IL3 小鼠組織染色,發(fā)現(xiàn)小鼠的肺和脾中都含有較多人肥大細(xì)胞的標(biāo)志物(人胰蛋白酶),該小鼠模型中的人類肥大細(xì)胞的表型與原代人類肥大細(xì)胞相似,并表達(dá)CD117、類胰蛋白酶和FcεRI,所以 NSG-SCF/GM-CSF/IL3 小鼠模型獨特的優(yōu)勢在于肥大細(xì)胞可以進(jìn)行脫顆粒,且可在體外培養(yǎng)用于其他研究[35]。

4.2 人類免疫細(xì)胞或干細(xì)胞植入NOD-sciD-γ-/-小鼠

NOD-sciD-γ-/-小鼠的特點是非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD),嚴(yán)重免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID),并且缺乏通用的γ 鏈(γc;IL-2Rγ)功能。 該小鼠沒有小鼠 T 細(xì)胞和B 細(xì)胞,缺乏殘留的NK 細(xì)胞活性,并且存在高植入人細(xì)胞的比率[36-37]。 Weigmann 等[38]通過腹腔注射來自過敏原供體的外周血單核細(xì)胞建立腸道炎癥模型。 在細(xì)胞轉(zhuǎn)移后三周,對腸道進(jìn)行口服過敏原激發(fā),并采用高分辨率視頻微型內(nèi)窺鏡系統(tǒng)監(jiān)測腸道炎癥以及組織,發(fā)現(xiàn)小鼠腸道粘膜增多,腸壁增厚肥大、炎癥細(xì)胞浸潤等腸道炎癥病變。 此模型小鼠建模具有可靠性且重現(xiàn)性好等特點。

4.3 FcεRI 小鼠模型

人類食管樹突狀細(xì)胞和小腸固有層FcεRI 是IgE 的主要受體。 Sallmann 等[39]建立了樹突狀細(xì)胞表面攜帶人的FcεRI 的人源化小鼠,并采用100 μg OVA 腹腔致敏,研究發(fā)現(xiàn)來自α-DC TG 小鼠的樹突狀細(xì)胞對IgE 具有強(qiáng)烈的結(jié)合力,同時FcεRI 依賴性增強(qiáng)以及體內(nèi)發(fā)生了T 細(xì)胞活化的過程。 α-DC TG 小鼠OVA 特異性T 細(xì)胞增殖與野生型相似,體內(nèi) DC 上 IgE 與 FcεRI 的結(jié)合誘導(dǎo)對 Ag 特異性記憶 T 細(xì)胞的增殖。 Platzer 等[40]利用表達(dá)人 FcεRI小鼠,連續(xù)兩次腹膜注射100 μg OVA 致敏,隔日連續(xù)3 ～6 次50 mg OVA 灌胃,發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)較高的致敏反應(yīng)。 小鼠腸部組織中肥大細(xì)胞特異性蛋白酶及數(shù)量、Th2 型細(xì)胞因子(IL-4 和 IL-13)和 DC 衍生的炎癥介質(zhì)迅速增加,其中腸和腸粘膜肥大細(xì)胞數(shù)量是用來評估食物過敏小腸的組織炎癥程度;同時在這些實驗性食物過敏的小鼠模型中,可分析IgE/FcεRI 結(jié)合對腸粘膜炎癥反應(yīng)。 該模型為研究IgE/FcεRI 介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞與過敏性炎癥反應(yīng)提供可靠小鼠模型。

5 結(jié)論

小鼠食物過敏模型可分為依賴佐劑模型、無佐劑模型、基因工程模型、人源化模型(表1)。 比較目前可用的食物過敏模型只能部分地模擬食物過敏疾病的特征,不能完全反應(yīng)臨床特征。 食物誘導(dǎo)和佐劑輔助的模型常用于研究食物過敏疾病,除了蛋白質(zhì)本身的致敏性外,佐劑輔助也會影響蛋白質(zhì)的免疫原性和過敏原性,此致敏方式較貼近實際生活中食物蛋白攝入的情況;人類IgE 具有高度的物種特異性,并且不會交叉與嚙齒動物受體反應(yīng),轉(zhuǎn)基因小鼠模型不僅可用于研究某一基因的改變在食物過敏疾病的發(fā)生和發(fā)展的重要性,還可獲得能夠?qū)θ说腎gE 產(chǎn)生的過敏反應(yīng)模型;人源化小鼠模型可以克服種族特異性,真實的模擬人類食物過敏,表現(xiàn)出更強(qiáng)的針對性,對免疫系統(tǒng)功能失調(diào)導(dǎo)致的疾病和新細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)及功能研究提供了很好的模型[41]。 這些小鼠模型為人類食物過敏發(fā)病機(jī)制、藥物開發(fā)提供科學(xué)基礎(chǔ)。

表1 食物過敏小鼠模型Table 1 Mouse model of food allergy

品系Mouse strain致敏Sensitization激發(fā)Challenge過敏表型Allergy Phenotype參考文獻(xiàn)Reference Il4rαF709 5 mg OVA (和20 mg CT),灌胃5 mg OVA + 20 mg CT,i.g.150 mg OVA,灌胃150 mg OVA,i.g.體溫下降、腹瀉;腸道肥大細(xì)胞數(shù)量增加;IL-4、IgE 表達(dá)增加;STAT6 磷酸化增強(qiáng)。 Temperature drop, diarrhea.Increased number of intestinal mast cells. Increased expression of IL-4 and IgE.Enhanced phosphorylation of STAT6.[23]CNS1-/- ─ ─體重下降;胃腸道病理變化;肺部炎性特征,腸炎癥;Th2 反應(yīng)傾斜;IL-4、IL-5、IL-13 表達(dá)升高;GATA3+、CD4+ T 細(xì)胞數(shù)量增加;特異性IgE 和IgA 水平升高。Weight loss. Gastrointestinal pathological changes. Pulmonary and intestinal inflammatory characteristics. Th2 reaction. IL-4,IL-5, IL-13 increased expression. Increased number of GATA3+and CD4+ T cells. Increased specific IgE and IgA levels.[29]人源化小鼠模型Humanized mouse model NOG IL-3/GM NOD-sciD-γ-/-植入人胸腺、肝和造血干細(xì)胞Transfer of human thymus, liver and hematopoietic stem cells.注射過敏性供體外周血與相對的過敏原(20 μg),8 d 后過敏原增加20 μg Inject allergic donor PBMC and the opposite allergen (20 μg), the allergen increased by 20 μg after 8 days.─過敏原直腸注射(20 μg)或口服(50 μg)Allergen rectal(20 μg)injection or oral ( 50 μg).人總骨髓細(xì)胞(CD33+),粒細(xì)胞(CD66b+)和單核細(xì)胞(CD14+)顯著增加;具有人嗜酸性粒細(xì)胞,嗜堿性粒細(xì)胞,嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞;人胰蛋白酶表達(dá)升高。Significant increase in human total bone marrow cells(CD33+), granulocytes (CD66b+) and monocytes (CD14+).With human eosinophils, basophils, neutrophils and mast cells.Increased expression of human trypsin.胃腸道炎癥;產(chǎn)生過敏原特異性IgE;特異性T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生。Gastrointestinal inflammation. Production of allergen-specific IgE. Specific T cell proliferation and cytokine production.[35][38]α-DC ─100 μg OVA 腹腔注射或表皮致敏 (4 周),OVA(4% w/v) 或樺樹粉提取物(1% w/v)霧化兩天100 μg OVA Intraperitoneal injection or epidermal sensitization (4 weeks), OVA (4% w/v)or birch powder extract(1% w/v) atomization for two consecutive days.腸部組織中肥大細(xì)胞數(shù)量、Th2 型細(xì)胞因子、特異性蛋白酶表達(dá)增加;脾、淋巴結(jié)等器官中樹突狀細(xì)胞增加;T 細(xì)胞刺激增強(qiáng)。Increased number of mast cells, Th2 cytokines, and specific proteases in intestinal tissue. Increased dendritic cells in spleen,lymph nodes and other organs. T cell stimulation increased.[39]