劉輝 何太波 趙國(guó)淼

摘 ? ? ?要：采用Golden Gate Assembly的方法，將糖化酶基因glaA導(dǎo)入到實(shí)驗(yàn)室前期篩選的一株耐高溫釀酒酵母S.C HR的基因組中，篩選到了一株同時(shí)具有耐高溫及產(chǎn)糖化酶特性的功能型酵母COTYT-H。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所構(gòu)建的COTYT-H菌株能夠分泌糖化酶，且能夠在高溫條件下具有良好的發(fā)酵性能，應(yīng)用該菌株可在減少冷卻水用量、糖化酶用量、降低能耗、節(jié)約生產(chǎn)成本的同時(shí)，提高原料利用率，提升生產(chǎn)效益。

關(guān) ?鍵 ?詞：糖化酶;酵母;乙醇

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ 926.4 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）08-1703-04

Abstract： The Golden Gate Assembly method was used to introduce the glucoamylase gene glaA into the genome of a thermotolerant yeasts SC HR which was screened earlier in the laboratory. A functional yeast COTYT with both high temperature resistance and saccharifying enzyme properties was selected. The fermentation experiment results showed that the COTYT-H strain constructed in this research could secrete saccharifying enzymes and had good fermentation performance under high temperature conditions. The application of this strain could reduce the amount of cooling water， the amount of saccharifying enzymes， reduce energy consumption and costs， as well as increase the utilization rate of raw materials and improve production efficiency.

Key words： Glucoamylase1; Yeast; Alcohol

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是長(zhǎng)期并廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)、乙醇生產(chǎn)及食品等行業(yè)的重要微生物[1]。酵母不能直接利用淀粉生產(chǎn)乙醇，因此通常采用糖化酶來(lái)分解淀粉[2-3]以供酵母利用。糖化酶亦稱(chēng)葡萄糖淀粉酶、α-1，4-葡萄糖水解酶，從淀粉非還原性末端依次水解α-1，4-葡萄糖苷鍵，并使水解下來(lái)的葡萄糖構(gòu)象發(fā)生改變，形成β-D-葡萄糖[4-6]。把糖化酶基因引入到釀酒酵母中，構(gòu)建能分泌糖化酶的釀酒酵母，是目前酒精工業(yè)的研究方向之一[7-9]。目前酒精生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的糖化酶主要產(chǎn)自黑曲霉（Aspergillus niger）、臭曲霉（Aspergillus foetides）、得氏根霉（Rhizopus niveus）和泡盛曲霉（Aspergillus awamori）等[10]。

在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，釀酒酵母需要面對(duì)高溫、滲透壓和乙醇等多種環(huán)境因素的脅迫[11-12]。傳統(tǒng)的釀酒酵母乙醇發(fā)酵的最適溫度在28～33 ℃，最高耐受溫度為35 ℃[13]。但在我國(guó)南方及盛夏時(shí)的北方地區(qū)，由于環(huán)境溫度較高以及發(fā)酵設(shè)備換熱能力不足，導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)部核心溫度可達(dá)到40 ℃以上，嚴(yán)重抑制了酵母菌的生長(zhǎng)和代謝，嚴(yán)重降低了生物乙醇的生產(chǎn)效率[14]。應(yīng)用既能產(chǎn)糖化酶又能在高溫環(huán)境下具有良好發(fā)酵性能的釀酒酵母菌株，在發(fā)酵溫度較高時(shí)，可在保證酵母代謝正常進(jìn)行的同時(shí)減少冷卻水用量，降低生產(chǎn)負(fù)荷，減少生產(chǎn)能耗。另外，其產(chǎn)糖化酶的特性，可自身分泌一部分的糖化酶，減少糖化酶的使用量，節(jié)約生產(chǎn)成本[15]。

本研究采用Golden Gate重組的方法[16-18]構(gòu)建糖化酶基因glaA在釀酒酵母中的表達(dá)載體，將表達(dá)載體導(dǎo)入到實(shí)驗(yàn)室前期篩選的一株耐高溫釀酒酵母S.C HR中進(jìn)行整合，篩選出3株具有糖化功能的耐高溫釀酒酵母。進(jìn)一步的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，COTYT-H菌株具有耐高溫及產(chǎn)糖化酶的性能，能減少糖化酶的使用量，節(jié)約輔料成本。同時(shí)，其耐高溫的特性在維持生產(chǎn)穩(wěn)定的同時(shí)降低冷凍水用量，降低能耗，節(jié)約生產(chǎn)成本，適合于乙醇的大規(guī)模生產(chǎn)。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株和質(zhì)粒

出發(fā)菌株S.C HR為前期實(shí)驗(yàn)室誘變篩選到的耐高溫釀酒酵母;用于活性檢測(cè)酶表達(dá)用的畢赤酵母P. pastoris GS115和用于質(zhì)粒構(gòu)建、基因克隆的克隆宿主大腸桿菌（E. coli）DH5α均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室;P. pastoris的表達(dá)質(zhì)粒pGAPZa為組成型表達(dá)質(zhì)粒，由實(shí)驗(yàn)室前期自行構(gòu)建保存;糖化酶表達(dá)盒的構(gòu)建采用Golden Gate Assembly的方式進(jìn)行組裝，中間構(gòu)建質(zhì)粒均為實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建保存。

1.1.2 ?培養(yǎng)基

YPD固體培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，15%瓊脂。

YPS固體培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%可溶性淀粉，15%瓊脂。

2YT固體培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：1%酵母提取物，1.6%蛋白胨，0.5%NaCl，15%瓊脂。

1.2 ?分析方法

1.2.1 ?糖化酶基因篩選

通過(guò)對(duì)brenda-enzymes、PDB、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比對(duì)，獲得來(lái)源多個(gè)微生物的glaA基因，通過(guò)序列比對(duì)分析，選中來(lái)源扣囊復(fù)膜酵母Saccharomycopsis fibuligera的糖化酶glaA（Accession 19032257），氨基酸序列如下：

MIRLTVFLTAVFAAVASCVPVELDKRNTGHFQAYSGYTVARSNFTQWIHEQPAVSWYYLLQNIDYPEGQFKSAKPGVVVASPSTSEPDYFYQWTRDTAITFLSLIAEVEDHSFSNTTLAKVVEYYISNTYTLQRVSNPSGNFDSPNHDGLGEPKFNVDDTAYTASWGRPQNDGPALRAYAISRYLNAVAKHNNGKLLLAGQNGIPYSSASDIYWKIIKPDLQHVSTHWSTSGFDLWEENQGTHFFTALVQLKALSYGIPLSKTYNDPGFTSWLEKQKDALNSYINSSGFVNSGKKHIVESPQLSSRGGLDSATYIAALITHDIGDDDTYTPFNVDNSYVLNSLYYLLVDNKNRYKINGNYKAGAAVGRYPEDVYNGVGTSEGNPWQLATAYAGQTFYTLAYNSLKNKKNLVIEKLNYDLYNSFIADLSKIDSSYASKDSLTLTYGSDNYKNVIKSLLQFGDSFLKVLLDHIDDNGQLTEEINRYTGFQAGAVSLTWSSGSLLSANRARNKLIELL。

送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成并進(jìn)行參照釀酒酵母偏愛(ài)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)密碼子優(yōu)化后的基因序列信息設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物GA-F1和GA-SP-R1，并以全基因合成的glaA質(zhì)粒為模板擴(kuò)基因。其中擴(kuò)增引物為：

GA-F1：AACACTGGACATTTCCAAGC;GA-SP-R1：TCAAAGAAGTTCAATCAATTTGTT。

選用釀酒酵母強(qiáng)啟動(dòng)子和a-factor信號(hào)肽，采用OE PCR擴(kuò)增獲得帶有信號(hào)肽的糖化酶片段，隨后采用golden gate assembly的方法構(gòu)建完成糖化酶表達(dá)盒（圖1）。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證表達(dá)盒無(wú)誤后，采用OE PCR 連接抗性基因表達(dá)盒，選取釀酒酵母基因組多拷貝的rDNA為糖化酶基因的整合位點(diǎn)，采用Q5高保證酶一步擴(kuò)增獲得組裝完成的基因組整合大片段。

1.2.2 ?耐高溫糖化酵母的構(gòu)建

利用質(zhì)粒提取試劑盒提取大腸桿菌中測(cè)序驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒。按照Bln I酶切體系將5～10 μg質(zhì)粒在37 ℃水浴鍋中酶切線性化過(guò)夜;酶切產(chǎn)物的純化按照DNA純化回收試劑盒進(jìn)行操作，回收后的線性化片段與80 μL GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，電擊后立刻加入1 mL 1 mol·L-1預(yù)冷山梨醇，然后在30 ℃培養(yǎng)箱靜置孵育1～2 h。5 000 r·min-1離心1 min，棄上清液，用 100 μL 1 mol·L-1的山梨醇重懸，重懸的細(xì)胞涂布于含有zeocin抗生素的YPD平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況;以平板上挑取的單菌落作為模板，所述菌落PCR條件進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定，PCR反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選得到陽(yáng)性菌株。挑取生長(zhǎng)出來(lái)的單克隆轉(zhuǎn)板至YPS平板進(jìn)行糖化酶活性粗篩，整合糖化酶的基因工程菌在YPS平板上可見(jiàn)明顯的淀粉水解圈。進(jìn)而挑取具有水解圈的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)3 d后，對(duì)其培養(yǎng)集中的糖化酶采用DNS方法進(jìn)行酶活檢測(cè)。

1.2.3 ?重組釀酒酵母減糖化酶發(fā)酵性能驗(yàn)證

以液化醪為底物，將目前工業(yè)生產(chǎn)使用商業(yè)釀酒酵母菌株（商業(yè)酵母）及構(gòu)建獲得的菌株分別接種YPD搖瓶（500 mL），經(jīng)過(guò)培養(yǎng)達(dá)到一定的酵母數(shù)，按0.125億·mL-1液化醪折算用量，離心、水洗一次，用生理鹽水懸浮至2.5 mL，洗凈后分別接種至加量0.9 kg·t-1糧（添加比例100%）和0.45 kg·t-1糧（添加比例50%）外源糖化酶的350 g液化醪中，發(fā)酵72 h，其中商業(yè)酵母一實(shí)驗(yàn)組（100%糖化酶加量）發(fā)酵溫度32 ℃至發(fā)酵結(jié)束，期間溫度不調(diào)整，剩余實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行調(diào)整發(fā)酵，調(diào)整方案：0～16 h溫度32 ℃，17 h溫度調(diào)至33 ℃，18 h溫度調(diào)至34 ℃，19 h溫度調(diào)至35 ℃至發(fā)酵結(jié)束。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?糖化酶基因克隆及檢測(cè)

用高保真Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增得到glaA的cDNA序列約1 500 bp，與目的基因大小相符（圖2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化回收后，與克隆載體pMD18相連轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性克隆后送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，與S.fibuligera糖化酶（Accession 19032257）序列相似性為100%，證明已克隆得到glaA基因。

2.2 ?重組表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

glaA與GS115連接轉(zhuǎn)化后，在LB/zeocin抗性平板上挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切得到約1 500 bp的產(chǎn)物，證明酵母重組表達(dá)載體GS115-glaA構(gòu)建成功。選用釀酒酵母強(qiáng)啟動(dòng)子和a-factor信號(hào)肽（引導(dǎo)糖化酶分泌胞外表達(dá)）構(gòu)建糖化酶表達(dá)盒，采用OE PCR擴(kuò)增獲得帶有信號(hào)肽的糖化酶片段，隨后采用golden gate assembly的方法構(gòu)建完成糖化酶表達(dá)盒，擴(kuò)增結(jié)果如圖3。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證表達(dá)盒無(wú)誤后，進(jìn)一步用Q5高保證酶擴(kuò)增糖化酶表達(dá)盒，采用OE PCR連接抗性基因表達(dá)盒，選取釀酒酵母基因組多拷貝的rDNA為糖化酶基因的整合位點(diǎn)，采用Q5一步擴(kuò)增獲得組裝完成的基因組整合大片段，電泳結(jié)果如圖4。

2.3 ?糖化酶基因克隆及檢測(cè)

對(duì)挑取出的具有水解圈的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)3天后，對(duì)其培養(yǎng)基中的糖化酶采用DNS方法進(jìn)行酶活檢測(cè)。由表1結(jié)果可知，整合耐高溫釀酒酵母S.C HR基因組后獲得了不同酶活水平的糖化酶釀酒酵母COTYT-H、COTYT-M和COTYT-L，其中COTYT-H酶活較高，COTYT-M次之，COTYT-L酶活最低。

2.4 ?功能型酵母發(fā)酵效果評(píng)價(jià)

2.4.1 ?成熟醪殘?zhí)菍?duì)比

殘總糖是酒精發(fā)酵后醪液內(nèi)殘留的糖分，是衡量酒精發(fā)酵程度的重要指標(biāo)之一，控制殘?zhí)强捎行岣甙l(fā)酵水平，提升經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)表2的數(shù)據(jù)可以看出，商業(yè)酵母在高溫發(fā)酵條件下，殘總糖含量明顯升高，而功能型酵母在高溫發(fā)酵條件下仍能保持較低的殘總糖含量，在糖化酶加量降低50%以后，COTYT-H菌種仍具有較好的發(fā)酵效果。

2.4.2 ?成熟醪酒精度對(duì)比

通過(guò)圖5的數(shù)據(jù)可以看出，商業(yè)酵母在高溫發(fā)酵條件下，成熟醪內(nèi)酒分含量明顯降低，而使用功能型酵母，高溫發(fā)酵條件下仍能保持較好的發(fā)酵水平，在糖化酶加量降低50%以后，COTYT-H菌種成熟醪酒分仍高于商業(yè)酵母（糖化酶100%，不調(diào)整溫度）實(shí)驗(yàn)組。

3 ?結(jié)束語(yǔ)

本研究成功將糖化酶基因?qū)肽透邷蒯劸平湍富蚪M中，并最終獲得了3株可用于工業(yè)發(fā)酵驗(yàn)證的糖化酵母COTYT-H、COTYT-M和COTYT-L。發(fā)酵性能測(cè)定結(jié)果顯示：糖化酵母COTYT-H經(jīng)真實(shí)物料中試驗(yàn)證可有效節(jié)省50%糖化酶的使用，發(fā)酵的各項(xiàng)指標(biāo)與糖化酶不減量的市售釀酒酵母發(fā)酵性能一致，達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)對(duì)菌株發(fā)酵指標(biāo)的各項(xiàng)要求，可用于乙醇工業(yè)化生產(chǎn)。

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