韓浩園， 權(quán)凱， 閆志浩， 高慧軍， 劉德奇， 王先寧， 尹慧茹，趙金艷， 賈萬(wàn)里， 李紅霞， 余世鋒， 王擁慶， 李君

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.西峽縣畜牧局，河南 南陽(yáng) 474500；3．南陽(yáng)市獸藥監(jiān)察所，河南 南陽(yáng) 473068； 4．南陽(yáng)市畜牧局，河南 南陽(yáng) 473068；5．沈丘縣農(nóng)牧科技研發(fā)中心，河南 周口 466300； 6．河南健羊牧業(yè)有限公司，河南 南陽(yáng) 473000)

線粒體DNA(mtDNA)是除細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)外，唯一存在于胞質(zhì)細(xì)胞器內(nèi)的一種遺傳物質(zhì)。mtDNA遵循母系遺傳，mtDNA的D環(huán)控制區(qū)(D-loop)常被作為研究起源進(jìn)化和遺傳多樣性的有效分子標(biāo)記[1-2]，用于探究母系親緣關(guān)系、遺傳多樣性以及進(jìn)化發(fā)育等。利用線粒體DNA研究山羊多態(tài)性和起源進(jìn)化取得了一些有意義的成果，但同其他物種相比較，有關(guān)羊線粒體基因組及線粒體DNA的研究相對(duì)較少[3-7]。山羊的mtDNA D-loop區(qū)由16,640個(gè)堿基構(gòu)成[8]，D-loop控制區(qū)大小為1 212 bp，目前對(duì)山羊D-loop區(qū)的研究大多選取高變區(qū)作為研究對(duì)象?；趍tDNA的研究結(jié)果，山羊群體遺傳多樣性豐富[9]，具有多母系起源并且在不同時(shí)間經(jīng)歷過不同的群體擴(kuò)張。山羊線粒體DNA存在7個(gè)高度分化的單倍型分支(A, B1, B2, C, D, F, G)[10-11]。CHEN等研究了中國(guó)山羊線粒體DNA序列變異情況，分析得出中國(guó)山羊具有豐富的遺傳多樣性，并且首次報(bào)道了中國(guó)家山羊具有A、B、C和D 4個(gè)支系[12]，而且沒有明顯的地理遺傳結(jié)構(gòu)[13-16]。山羊線粒體DNA D-loop序列多態(tài)性較高，張紅平等[17]對(duì)中國(guó)16個(gè)家養(yǎng)山羊品種的308個(gè)個(gè)體的線粒體DNA D-loop區(qū)的研究結(jié)果表明，中國(guó)山羊的遺傳多樣性較為豐富。西藏山羊群體的線粒體DNA研究中共發(fā)現(xiàn)106個(gè)多態(tài)位點(diǎn)[18-19]。HOU等[20]對(duì)3個(gè)中國(guó)黑山羊群體研究也發(fā)現(xiàn)豐富的遺傳多樣性。

河南奶山羊是河南省地方奶羊品種，主要分布在河南省的開封、南陽(yáng)、洛陽(yáng)和鄭州等地區(qū)。河南奶山羊是1904年意大利天主教神父潭維新(Noe-Joseph Tacconi，1873—1942年)將薩能奶山羊引入河南省開封和南陽(yáng)地區(qū)，與當(dāng)?shù)氐胤缴窖蚱贩N雜交，并經(jīng)過長(zhǎng)期選育形成的乳用山羊品種。該品種體型中等，耐粗飼、對(duì)農(nóng)區(qū)秸稈資源利用率高，繁殖率高，適合中部平原地區(qū)的氣候環(huán)境。目前，對(duì)于河南奶山羊遺傳關(guān)系的研究尚為空白，為了解河南奶山羊群體構(gòu)成與遺傳多樣性，本研究以河南奶山羊、薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和伏牛白山羊作為研究對(duì)象，通過分析mtDNA D-loop區(qū)全序列研究其遺傳多樣性，并利用mtDNA D-loop區(qū)的遺傳特性及序列，分析河南奶山羊與薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和伏牛白山羊的遺傳關(guān)系及遺傳分化，了解河南奶山羊的遺傳資源狀況，對(duì)河南奶山羊品種資源的保護(hù)、開發(fā)和合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

本研究采集河南奶山羊(n=20)、薩能奶山羊(n=12)、伏牛白山羊(n=12)和關(guān)中奶山羊(n=4)，共48個(gè)山羊個(gè)體的外周血樣本(表1)。血樣均為隨機(jī)抽測(cè)，利用 EDTA 抗凝管頸靜脈采血5 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。河南奶山羊樣品采自河南健羊牧業(yè)有限公司，薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊樣品采自洛陽(yáng)妙妙牧場(chǎng)有限公司，伏牛白山羊樣品由河南省內(nèi)鄉(xiāng)縣畜牧站提供。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取血樣基因組DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ缮ど锕こ?上海)股份有限公司合成山羊D-loop區(qū)特異性引物，F(xiàn)：5′-AACCACTATTAACCACATCTA-3′；R：5′-CACTTACCATGTAAAAGACCC-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板(100 ng·μL-1)1μL，正向引物和反向引物(10 μmol·L-1)各為1 μL，Taq PCR Master Mix 12.5 μL(1 U Taq Polymerase、5 μmol·L-1dNTP、0.2 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1KCl、0.03 mmol·L-1MgCl2)，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，53.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min 30 s，4 ℃保存。利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)產(chǎn)物大小與目的片段一致，送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)生工生物工程(上海)有限公司雙向測(cè)序，利用Lasergene軟件包中的SeqMan軟件將上下游測(cè)序序列拼接，去除測(cè)序質(zhì)量差的雜峰部分；利用MEGA6.0軟件[21]自帶的ClustalW多重比對(duì)對(duì)拼接好的序列進(jìn)行分析，利用截齊后的1 140 bp序列構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹，更改自舉檢驗(yàn)重復(fù)數(shù)為1000；分析河南奶山羊和伏牛白山羊、薩能奶山羊以及關(guān)中奶山羊間的遺傳關(guān)系，利用K2P(Kimura 2-parameter)模型[22]計(jì)算品種間的遺傳距離；導(dǎo)出MEGA 6.0比對(duì)后的FASTA格式序列，并導(dǎo)入DnaSP V5[23]分析4個(gè)山羊品種D-loop區(qū)的DNA多態(tài)性：?jiǎn)伪缎投鄻佣?Hd)、核苷酸多樣度(Pi)和中性檢驗(yàn)[24]，以及品種間基因流和遺傳分化：種群間核苷酸平均差異數(shù)(Kxy)、核苷酸歧義度(Dxy)、遺傳分化系數(shù)(GST)和固定系數(shù)(FST)等遺傳學(xué)參數(shù)；并利用DnaSP V5進(jìn)行單倍型分析，生成單倍型數(shù)據(jù)，導(dǎo)入NETWORK 10.0.0.0軟件(Fluxus Technology Ltd., Kiel, Germany)中構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體D-loop擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

4個(gè)山羊品種48個(gè)樣本經(jīng)由DNA提取和PCR擴(kuò)增得到圖1所示瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果，顯示擴(kuò)增效果良好，條帶清晰明亮，無雜帶，條帶大小約為1 200 bp，與預(yù)期目的條帶大小吻合，可用于后續(xù)測(cè)序及分析。

2.2 線粒體D-loop遺傳多樣性及單倍型分析

測(cè)序拼接后，將48個(gè)個(gè)體D-loop序列截為1 140 bp，其中單態(tài)位點(diǎn)為1 078個(gè)，突變位點(diǎn)為43個(gè)，缺失位點(diǎn)為19個(gè)。遺傳多樣性分析表明，4個(gè)山羊品種總單倍型多樣度為0.903，各品種單倍型多樣度范圍為0.391～0.814，總核苷酸多樣度為0.007 50，4個(gè)品種核苷酸多樣度的范圍為0.000 35～0.004 64，河南奶山羊均表現(xiàn)為最高的單倍型多樣度和核苷酸多樣度。4個(gè)山羊品種的核苷酸平均差異數(shù)為8.402(表1)。單倍型分析共發(fā)現(xiàn)16個(gè)單倍型，其中河南奶山羊有9個(gè)單倍型(Hap 4～12)，薩能奶山羊有3個(gè)單倍型(Hap 1～3)，關(guān)中奶山羊和伏牛白山羊分別有2個(gè)單倍型(Hap 13～14和Hap 15～16)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖明顯分為4個(gè)單倍型組，分別代表河南奶山羊、薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和伏牛白山羊(圖2)。河南奶山羊Tajima’s D 中性檢驗(yàn)P<0.05，顯著偏離中性，表明河南奶山羊經(jīng)歷過群體擴(kuò)張。薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和伏牛白山羊Tajima’s D 中性檢驗(yàn)均不顯著(P>0.1)，符合平衡發(fā)展，未出現(xiàn)群體大規(guī)模擴(kuò)張或瓶頸現(xiàn)象，群體大小保持相對(duì)穩(wěn)定。

注：M.Marker;1、2.河南奶山羊、3、4.薩能奶山羊;5.關(guān)中奶山羊;6.伏牛白山羊。

表1 4個(gè)山羊品種遺傳多樣度及單倍型Table 1 Genetic diversity of four goat breeds

注：H_1～16代表單倍型Hap 1～16。

2.3 基因流與遺傳分化分析

品種間基因流與遺傳分化分析結(jié)果表明，核苷酸平均差異數(shù)范圍為9.333 33～13.666 67，核苷酸岐異度變異范圍為0.008 33～0.012 19，薩能奶山羊與伏牛白山羊間的核苷酸平均差異數(shù)和歧異度最低，而薩能奶山羊和河南奶山羊之間的最高。河南奶山羊與伏牛白山羊的核苷酸平均差異度和歧異度最小，其次是薩能奶山羊，與關(guān)中奶山羊差異最大(表2)。遺傳分化系數(shù)范圍為0.135 65～0.360 10，固定系數(shù)范圍為0.583 23～0.935 50，關(guān)中奶山羊與伏牛白山羊間的遺傳分化系數(shù)和固定系數(shù)最高(表2)。河南奶山羊與關(guān)中奶山羊分化系數(shù)最小，代表兩者間遺傳多態(tài)性差異最大，而與伏牛白山羊間的分化系數(shù)最大，代表兩者之間核苷酸差異最小，與前述核苷酸平均差異數(shù)和歧異度的結(jié)果相符，也與固定系數(shù)結(jié)果基本一致。

表2 遺傳分化與基因流相關(guān)參數(shù)Table 2 Genetic differentiation and gene flow of four breeds

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與遺傳距離分析

4個(gè)山羊品種間系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)表明，河南奶山羊首先與伏牛白山羊聚為一支，其遺傳距離為0.008 553 6；接著河南奶山羊與薩能奶山羊聚類，其遺傳距離為0.009 136 8；最后與關(guān)中奶山羊聚類，其遺傳距離為0.010 649 1。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果與遺傳距離分析結(jié)果相符(表3)，證明了河南奶山羊與伏牛白山羊遺傳關(guān)系最近，接著是薩能奶山羊，離關(guān)中奶山羊最遠(yuǎn)。該結(jié)果與遺傳分化分析結(jié)果一致。

注：H.河南奶山羊;SN.薩能奶山羊;G.關(guān)中奶山羊;F.伏牛白山羊。

3 結(jié)論與討論

3.1 河南奶山羊遺傳多樣度

核苷酸多樣度和單倍型多樣度是評(píng)價(jià)群體遺傳分化的重要指標(biāo)，數(shù)值越大，表明群體遺傳多樣性越豐富。本研究的遺傳多樣性分析表明，3個(gè)奶山羊品種單倍型多樣度為0.429～0.814，核苷酸多樣度為0.001 14～0.004 64。本研究結(jié)果與皮秀霜[25]對(duì)關(guān)中奶山羊、文登奶山羊和嶗山奶山羊遺傳多樣性研究結(jié)果相一致，關(guān)中奶山羊、文登奶山羊和嶗山奶山羊的平均核苷酸多樣度為0.009 8±0.000 9，平均單倍型多樣度為0.865±0.010。中國(guó)奶山羊品種核苷酸多樣度低于云貴川地方山羊品種，川渝黔地區(qū)山羊線粒體D-loop遺傳多樣性

表3 河南奶山羊、伏牛白山羊、薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊間的遺傳距離Table 3 The genetic distance of Henan dairy goat, Funiu white goat, Saanen dairy goat and Guanzhong dairy goat

研究表明核苷酸多樣度范圍為0.004～0.040[26-28]，云南地方山羊單倍型多樣性為0.985，平均核苷酸多樣性為0.019 15[29-30]，顯示出川渝黔地區(qū)山羊品種較高的遺傳多樣性。中國(guó)奶山羊品種均以薩能奶山羊?yàn)楦副?，?jīng)過與地方品種長(zhǎng)期的雜交改良和選育形成，血統(tǒng)來源相對(duì)單一，可能是造成中國(guó)奶山羊多樣度較低的原因。

本研究結(jié)果表明,河南奶山羊單倍型多樣度和核苷酸多樣度最高，依次為薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和伏牛白山羊，從品種形成來看，河南奶山羊母本來源包括槐山羊、伏牛白山羊和堯山白山羊，品種數(shù)量多、群體大，而薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和伏牛白山羊母本來源相對(duì)單一、數(shù)量小。因此，河南奶山羊單倍型多樣度和核苷酸多樣度遠(yuǎn)高于其他3個(gè)品種。

本研究在河南奶山羊、關(guān)中奶山羊、薩能奶山羊和伏牛白山羊界定16個(gè)mt DNA D-loop單倍型，每個(gè)品種均存在特異單倍型，該結(jié)果與王杰[31]、趙中權(quán)等[32]的報(bào)道相一致，說明中國(guó)奶山羊不同群體都具有獨(dú)特的mt DNA D-loop單倍型，不同品種間共享單倍型較少，類群?jiǎn)伪缎拓S富。

3.2 河南奶山羊群體擴(kuò)張

本研究中河南奶山羊Tajima’s D值為0.190 07，P<0.05，差異顯著，表明河南奶山羊存在過群體擴(kuò)張，ZHAO等研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)的奶山羊品種支系A(chǔ)顯著偏離中性，曾經(jīng)歷群體擴(kuò)張[16,20]。歷史對(duì)于線粒體DNA的遺傳變異模式和遺傳多樣性都具有深遠(yuǎn)影響，對(duì)畜禽群體來說，環(huán)境條件的改變，可導(dǎo)致隨機(jī)漂變和等位基因頻率的改變，當(dāng)群體數(shù)量發(fā)生大的變化時(shí)，可以檢測(cè)到其是否發(fā)生過群體擴(kuò)張。目前，河南奶山羊規(guī)模場(chǎng)主要分布在南陽(yáng)市西峽縣，西峽縣政府在近些年來將河南奶山羊作為畜牧業(yè)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)進(jìn)行大力發(fā)展，河南奶山羊得到了快速的擴(kuò)張和發(fā)展。

3.3 河南奶山羊遺傳距離和遺傳分化

本研究發(fā)現(xiàn)河南奶山羊與伏牛白山羊遺傳距離為0.008 553 6，與薩能奶山羊聚類，其遺傳距離為0.009 136 8；最后與關(guān)中奶山羊聚類，其遺傳距離為0.010 649 1，表明河南奶山羊和伏牛白山羊母系遺傳關(guān)系最近，其次是薩能奶山羊，離關(guān)中奶山羊最遠(yuǎn)，本研究結(jié)果從遺傳角度證實(shí)了河南奶山羊是以薩能奶山羊?yàn)楦副?，以伏牛白山羊?yàn)槟副具x育而成。皮秀霜[21]發(fā)現(xiàn)中國(guó)奶山羊品種間的遺傳距離變異范圍為0.004 7～0.013 8，本研究結(jié)果與該結(jié)果相近。本研究發(fā)現(xiàn)河南奶山羊與薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊間存在單倍型特異性與明顯的遺傳分化，證明河南奶山羊與其他奶山羊間存在明顯差別。