和春昊， 金鉞， 張晨昕， 郭珍珍， 李濱洲， 吳秋玲， 王亞賓，3， 陳麗穎，3

(1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002； 2.北京化工大學國際教育學院，北京 1022002； 3.河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 450002)

腸球菌(Enterococcus)是存在于人和動物腸道內的一種常見機會致病菌，也是引起醫(yī)院內感染的主要原因之一[1]，其中以糞腸球菌(E.faecalis)感染最為常見[2]。作為機體常在菌群成員之一，腸球菌在宿主組織完整性被破壞時，可憑借其毒力因子膠原蛋白黏附素(Adhesin of collagen from Enterococcus, Ace)的輔助黏附、定植于宿主細胞，進而導致人和動物的機會性感染[3-4]。Ace是一種分泌于細菌表面、染色體編碼的蛋白質，由721個氨基酸殘基構成，參與腸球菌與宿主細胞的胞外基質蛋白(Extracellular matrix proteins, ECM)黏附；它有良好的黏附活性，在菌體生物膜形成過程中起重要作用，并且，Ace可誘導產生具有良好保護性的抗體，因此已成為腸球菌疫苗研發(fā)的重點候選抗原。鐵蛋白(ferritin)是一個普遍存在于多種微生物到高等動植物體內、相對分子量約為450 ku的中空納米蛋白籠[5-6]。其組成包括蛋白和鐵核兩部分，其中蛋白部分也稱為脫鐵鐵蛋白(apoferritin)，由24個亞基通過非共價鍵結合形成高度對稱的中空結構。哺乳動物的鐵蛋白亞基主要有H亞基(約21 ku)和L亞基(約19 ku)2種，在哺乳動物不同組織或發(fā)育階段，H/L亞基按照不同比例進行組裝，從而構成一個龐大的儲鐵蛋白家族 (isoferritins)[7-8]。富含L亞基的鐵蛋白(肝、脾臟中)含鐵量高，存儲功能強，而富含H亞基的鐵蛋白多存在于心、腦組織中，具有顯著的抗氧化活性[9]。

鐵蛋白對高溫(70～80 ℃)和多種變性劑都比較穩(wěn)定，但對酸堿度非常敏感，在pH 2.0時鐵蛋白籠發(fā)生解離，變成游離亞基，而在pH 7.0時又能重新自發(fā)組裝成蛋白納米籠[10-11]。更重要的是，鐵蛋白自身并無抗原性，但它能增強抗原的免疫原性，提高免疫效果。因此，近年來已有人將鐵蛋白作為納米佐劑應用于疫苗創(chuàng)制并取得了良好效果[11-13]。本研究旨在以鐵蛋白H亞基為載體，將該基因與糞腸球菌Ace抗原的不同表位基因片段偶聯(lián)并進行融合表達，以獲得攜帶抗原表位的自組裝鐵蛋白納米籠，然后進行動物免疫接種試驗觀察其免疫效果。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

攜帶有糞腸球菌膠原蛋白黏附素基因ace片段的質粒pET-32a-ace及同時攜帶鐵蛋白H亞基基因的質粒pET-32a-ace-H均由河南農業(yè)大學預防獸醫(yī)系微生物實驗室 構建并保存[14]。豬源糞腸球菌Ace陽性血清(一抗)由本實驗室制備并保存，羊抗兔IgG-HRP(二抗)購自美國博奧森公司[15]。40 d齡清潔級健康雄性家兔購自河南省實驗動物中心。

RT-PCR試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TRIzol、T4DNA連接酶、限制性內切酶HindⅢ與XhoI、蛋白酶抑制劑(PMSF)、Ni-Agarose填料以及2×Taq預混酶均購自康為世紀(北京)生物科技有限公司；蛋白酶K、DNA Marker和10× Loading Buffer均購自大連TaKaRa公司；預測的抗原表位基因DNA片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 重組質粒的構建與鑒定

根據(jù)豬源糞腸球菌ace基因序列( GenBank序列號NP_814829.1)，利用常用生物信息學軟件預測其抗原表位基因片段[16]，然后將篩選出的6個抗原表位基因序列送到生工生物工程(上海)股份有限公司進行DNA合成，這些基因序列上下游分別帶有BamH I和HindⅢ酶切位點。將上述6個基因片段分別與鐵蛋白H亞基基因片段連接，并插入pET-32a表達載體，構建重組質粒(命名為pET-32a-ace1-H～pET-32a-ace6-H)。同時構建含全長ace基因的重組質粒pET-32a-ace和pET-32a-ace-H。上述重組質粒經(jīng)雙酶切鑒定正確后，進行測序與比對分析。

1.3 融合蛋白的表達與鑒定

將各重組表達質粒分別轉入表達菌BL21(DE3)中，以終濃度為0.2 mmol·L-1的IPTG進行誘導表達，8 h后取出菌液，加入PMSF、溶菌酶、Triton X-100后進行超聲破碎，然后分別收集上清液和沉淀，煮沸后進行SDS-PAGE檢測，以確定重組蛋白的表達效果。各重組蛋白經(jīng)鎳柱純化，以咪唑緩沖液洗脫后，以抗Ace陽性血清作為一抗、羊抗兔IgG-HRP作為二抗，利用Western blot，以檢測抗原蛋白的免疫原性。

1.4 重組鐵蛋白納米顆粒免疫家兔試驗

將年齡相同、健康狀態(tài)一致的清潔級雄性家兔分為6個組，每組3只，分別以抗原蛋白/表位命名，其中Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H組為重組表位鐵蛋白納米顆粒疫苗組，而Ace組和Ace-H組分別為非納米顆粒對照組和多表位納米粒對照組，同時設立陰性對照組，不作任何處理。用各“重組融合蛋白+弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑”制備免疫原，分別對家兔進行免疫接種，接種蛋白量為1 mg·只-1，接種途徑為背部皮下多點注射。在首免(弗氏完全佐劑)后第2周、第3周和第4周，各進行一次強化免疫接種(弗氏不完全佐劑)，劑量為1 mg·只-1。分別在首次接種當日、首免后第2周、第3周和第4周(加強免疫時)及末次免疫1周時，經(jīng)耳緣靜脈采集各組試驗兔血液，分離血清，采用本實驗室前期建立的間接ELISA方法[14]檢測其血清中抗Ace抗體效價(OD450 nm)，分析各鐵蛋白納米顆粒免疫水平。

1.5 統(tǒng)計學分析

試驗所得結果經(jīng)GraphPad Prism 6軟件進行T檢驗分析，P<0.05代表結果具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建與鑒定

依據(jù)篩選出的6個豬源糞腸球菌Ace抗原線性表位合成了相應的基因片段ace1～ace6，依此構建出重組質粒pET-32a-ace1-H ～ pET-32a-ace6-H，將上述6個質粒及pET-32a-ace-H進行BamHI和XhoI雙酶切鑒定，結果顯示所得到的酶切片段與預期相符(圖1)?；蛐蛄袦y定結果顯示，各重組質粒均與GenBank公布的相應序列一致，表明本研究中的7個重組質粒pET-32a-ace-H和pET-32a-ace1-H ～ pET-32a-ace6-H均構建正確。

M:DL 10 000 DNA Marker；1、3、5、7、9、11、13：pET-32a-ace-H、pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace2-H pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace4-H、pET-32a-ace5-H、pET-32a-ace6-H雙酶切；2、4、6、8、10、12、14pET-32a-ace-H、pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace2-H、pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace4-H、pET-32a-ace5-H、pET-32a-ace6-H單酶切。

2.2 重組蛋白表達與Western blot分析結果

經(jīng)SDS-PAGE檢測，顯示在IPTG誘導下重組質粒pET-32a-ace-H、pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace5-H和pET-32a-ace6-H 均能夠在大腸桿菌BL21中可溶性表達，并得到了重組蛋白Ace-H、Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H；而另2種蛋白Ace2-H和Ace4-H則為包涵體形式，故棄去。上述可溶性表達產物經(jīng)Western blot檢測顯示均能在各自的目的條帶位置出現(xiàn)特異性條帶(圖2)，表明所獲得的純化重組蛋白均具有較好的免疫原性。

M: 蛋白Marker ；1：Ace1-H；2：Ace3-H；3：Ace5-H； 4：Ace6-H；5：Ace-H。

2.3 重組鐵蛋白納米顆粒免疫家兔后抗體水平檢測結果

用攜單一抗原表位的重組融合蛋白Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H及攜多表位的 Ace-H蛋白及單獨的Ace蛋白分別準備免疫原接種家兔后，于不同時間點采集血清并進行ELISA檢測。結果顯示，上述6種蛋白抗原免疫接種家兔后，均在家兔體內誘導產生了特異性抗體，其血清抗體水平(OD450 nm)消長動態(tài)如圖3所示。其中，與攜帶多表位的Ace蛋白以及Ace-H鐵蛋白納米顆粒相比，攜帶單個Ace表位的鐵蛋白納米顆粒Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H所誘導的抗體效價和變化動態(tài)具有較好的一致性，且以鐵蛋白納米粒Ace5-H 的免疫效果為最佳。經(jīng)T-檢驗分析結果表明，Ace5-H與陰性對照組組相比差異顯著(P<0.05)。幾種免疫原的免疫效果具有Ace5-H>Ace-H>Ace>Ace6-H>Ace3-H>Ace1-H的趨勢，表明鐵蛋白納米籠能有效增強蛋白質抗原的免疫原性(Ace5-H和 Ace-H)。

3 討論

疫苗接種是有效預防病原微生物感染的重要手段之一，尤其在當前由于濫用抗生素而導致細菌耐藥性日益嚴重的情況下，更需要研發(fā)、推廣使用精準、高效、持久又能節(jié)約機體免疫潛力的疫苗用于疫病預防，以減少和替代抗生素的使用。表位疫苗是近年來備受重視的一類新型疫苗，它只攜帶免疫原的抗原表位而非完整分子，具有安全性好、特異性強和節(jié)省免疫潛力等優(yōu)點，但表位疫苗大都存在著相對分子質量較小、免疫原性弱、易分解等缺陷，難以引起機體強烈而持久的免疫應答，因此選擇合適的佐劑尤為重要[17-18]。本研究表明，攜Ace單一表位及多個表位的重組鐵蛋白均能成功自組裝，形成與缺鐵核鐵蛋白基本一致的納米顆粒。而動物免疫試驗結果顯示，幾種免疫原均能誘導家兔產生特異性抗體水平，其中攜單一表位的重組鐵蛋白Ace5-H比攜多表位的Ace-H的免疫效果似乎更佳。究其原因，有可能是Ace分子量較大導致其結構變化而影響抗體的產生[19]。

圖3 不同Ace免疫原接種家兔后的

抗原的有效遞呈和特異性抗體的產生取決于抗原遞呈細胞(Antigen presenting cell，APC)的識別與攝取[19-20]。鐵蛋白納米籠相對分子質量較大，有可被修飾的亞基，能夠在一定環(huán)境下自組裝，且具有較高的生物安全性。鐵蛋白納米籠高度對稱，進入機體后是樹突狀細胞、巨噬細胞首選的吞噬目標，更易引起炎癥和免疫反應，因此更易于實現(xiàn)抗原識別和遞呈[21]。通過基因工程方法把抗原表位片段與鐵蛋白亞基偶聯(lián)，可以提高鐵蛋白載體荷載的抗原量，從而解決APC對可溶性抗原攝取量不足的問題，進而增強抗原免疫原性，提高免疫效果。研究表明，用原核表達的方法表達亞基單體，利用在生理環(huán)境下自組裝，制備出類似天然鐵蛋白中空的納米籠，含三聚體的納米顆粒免疫家兔能誘導產生更好的抗體免疫應答，保護效果更佳[12]。以鐵蛋白作為載體制備的流感病毒血凝素三聚體納米疫苗，能誘導產生高于傳統(tǒng)滅活三聚體疫苗的應答水平[13]。