賀亞斐， 張來星， 曹子敬， 吳坤， 張繼冉， 徐淑霞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

二氯喹啉酸(quinclorac)是德國巴斯夫股份公司開發(fā)的激素型喹啉羧酸類除草劑，對稗草治理作用明顯，在中國稻田中應(yīng)用廣泛[1]。二氯喹啉酸在土壤中殘留期長，難以自然降解，并且人們對其降解特性認識不足。大量施用二氯喹啉酸，會導(dǎo)致其在土壤和水體中大量殘留，對中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的危害[2]。周小會等[3]研究發(fā)現(xiàn)，二氯喹啉酸殘留在土壤中會對煙草根際土壤微生物數(shù)量產(chǎn)生明顯影響。此外，土壤中殘留的二氯喹啉酸會使煙草葉片發(fā)生畸形，葉面萎縮卷曲出現(xiàn)線狀，阻礙煙葉生長[4]。二氯喹啉酸降解受到光照和土壤理化性質(zhì)的影響，但是目前常用的方法包括物理吸附、光化學(xué)降解、化學(xué)水解和深耕翻土等并不能從根本上解決二氯喹啉酸在土壤中殘留的問題[5]。微生物在土壤中的代謝能夠改善土壤環(huán)境，促進土壤中二氯喹啉酸的降解，而二氯喹啉酸在土壤中的降解主要依靠微生物[6-7]。目前研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些二氯喹啉酸的降解菌，包括倉白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)的菌株LS[8]、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)的菌株J3[9]、分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp)的菌株F4[10]、博德特氏菌屬(Bordetella)的菌株HN36[11]、節(jié)桿屬菌株(Arthrobactersp.)的解菌MC-10[12]、鏈霉菌屬(Streptomycesp.)菌株AH-B[13]、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)的菌株J03[14]等。這些菌種對二氯喹啉酸都有良好降解效果，但是關(guān)于微生物降解二氯喹啉酸機制方面的研究較少。本研究從長期生產(chǎn)二氯喹啉酸的河南某農(nóng)藥廠污泥中分離出1株二氯喹啉酸降解菌，命名為WK1，對其進行形態(tài)學(xué)觀察以及生理生化鑒定，探索了菌株降解二氯喹啉酸的降解特性，并初步分析了二氯喹啉酸脅迫對菌體蛋白表達的影響，以期為二氯喹啉降在菌體內(nèi)降解機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 土樣采自河南省某農(nóng)藥廠土壤，采用5點取樣法取樣后帶回，自然風干后去除雜物過篩(18目)。

1.1.2 儀器與試劑 SDD-26A 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；DH-500A型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠)；BS-IIFA型立式恒溫搖床(常州市開元實驗儀器有限公司)；KIKRO-22R高速冷凍離心機(德國Hettick 公司)；超凈工作臺(上海瀘凈有限公司)；Axio光學(xué)顯微鏡(歐波有限公司)。二氯喹啉酸標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司，99.9%純度)；DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN公司)。其余試劑購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO41.0 g·L-1、NaH2PO41.0 g·L-1、NH4NO3g·L-1、CaCl2·H2O 0.02 g·L-1、FeCl3·3H2O g·L-1、 MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1；

LB培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g·L-1、胰蛋白胨10.0 g·L-1、酵母浸粉5.0 g·L-1。

1.2 二氯喹啉酸降解菌分離與純化

配制無機鹽培養(yǎng)基，加入二氯喹啉酸，使質(zhì)量濃度為100 mg·L-1。將1 g土壤樣本添加于99 mL配置過的無機鹽液體培養(yǎng)基內(nèi)，放置在37 ℃，180 r·min-1的恒溫搖床培養(yǎng)箱中7 d，然后取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于二氯喹啉酸質(zhì)量濃度為200 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，持續(xù)7 d后，再取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于二氯喹啉酸質(zhì)量濃度為500 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)7 d,稀釋接種在無機鹽固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3 d后挑取單菌落，連續(xù)培養(yǎng)10代后，平板劃線得到單菌落菌株。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 菌株的形態(tài)觀察和生理生化鑒定 將菌株接種于固體LB培養(yǎng)基內(nèi)，于35 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。生理生化鑒定試驗參照文獻[15]。

1.3.2 菌株16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將培養(yǎng)好的菌株通過試劑盒提取細菌總DNA。以細菌總DNA做模板，進行PCR擴增，引物為細菌通用引物 (上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/下游引物5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)。擴增反應(yīng)體系: DNA (80 ng·μL-1) 0.5 μL，Taq酶0.25 μL，dNTP(10 mmol·L-1) 1 μL，引物 (10 μmol·L-1)1 μL，10×Buffer 2.5 μL，補蒸餾水至50 μL。反應(yīng)條件: 94 ℃ 10 min， 94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min測序結(jié)果進行NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比對，并構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌懸液的制備

在LB培養(yǎng)基中接種菌株WK1，在37 ℃、180 r·min-1的恒溫搖床上培養(yǎng)至對數(shù)期，在離心機上5 000 r·min-1離心10 min收集菌體，以無菌水沖洗2次，重懸于培養(yǎng)基(OD600=1.0)，用于測定。

1.5 降解菌降解二氯喹啉酸的性能測定

二氯喹啉酸測定參考胡楊等[16]的HPLC方法。配置二氯喹啉酸質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的無機培養(yǎng)基，以質(zhì)量分數(shù)5%接種量接入菌株WK1(OD600=1.0)，180 r·min-1恒溫35 ℃培養(yǎng)，每12 h取樣，測定OD600和二氯喹啉酸質(zhì)量濃度。

1.6 降解條件對降解菌降解二氯喹啉酸的影響

1.6.1 接種量對降解菌降解二氯喹啉酸的影響 分別以質(zhì)量分數(shù)2%、5%、8%和10%的接種量接種到二氯喹啉酸質(zhì)量濃度為100 mg·L-1、pH值為7的無機鹽培養(yǎng)基中，在180 r·min-1恒溫37 ℃培養(yǎng)5 d，測定二氯喹啉酸的質(zhì)量濃度。

1.6.2 二氯喹啉酸初始濃度對降解效果的影響 分別配置二氯喹啉酸質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250、300 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)基，pH值為7，以質(zhì)量分數(shù)5%的接種量在180 r·min-1恒溫37 ℃培養(yǎng)5 d，測定二氯喹啉酸的質(zhì)量濃度。

1.6.3 溫度對降解效果的影響 以質(zhì)量分數(shù)5%的接種量接種到100 mg·L-1、pH值為7的二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基中，分別在25、30、35、40、45 ℃下，180 r·min-1恒溫培養(yǎng)5 d，測定二氯喹啉酸的質(zhì)量濃度。

1.6.4 pH值對降解二氯喹啉酸的影響 分別配置pH值為 4、5、6、7、8、9的100 mg·L-1二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基，并以質(zhì)量濃度為5%的接種量接種，在180 r·min-1恒溫35 ℃培養(yǎng)5 d，測定二氯喹啉酸的質(zhì)量濃度。

1.7 降解菌降解二氯喹啉酸的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取pH值(7、8、9)(A)、接種量質(zhì)量分數(shù)(4%、5%、6%)(B)、二氯喹啉酸的初始質(zhì)量濃度(90、100、110 mg·L-1)(C)和溫度(30、35、40 ℃)(D)為因素，設(shè)計4因素3水平菌株降解二氯喹啉酸的正交試驗，如表1所示。

表1 二氯喹啉酸降解正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal design of experiment of degradation of quinclorac

1.8 二氯喹啉酸脅迫對降解菌胞內(nèi)外蛋白的影響

菌液的制備：配置二氯喹啉酸質(zhì)量濃度為100 mg·L-1無機鹽培養(yǎng)基作為處理組，葡萄糖質(zhì)量濃度為100 mg·L-1無機鹽培養(yǎng)基為對照組。以質(zhì)量分數(shù)為5%的接種量接種降解菌，在180 r·min-1恒溫35 ℃培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)結(jié)束的菌液以5 000 r·min-1離心20 min，收集菌體和上清液，用無菌水洗滌2次，重懸于離心管中備用(OD600=2.5)。

降解菌胞內(nèi)外的蛋白提?。旱鞍滋崛⒖加喙γ鞯萚17]TCA丙酮沉淀法。將提取過后的蛋白進行SDS-PADE電泳試驗。電泳步驟按《蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)》[18]所述方法進行，濃縮膠質(zhì)量濃度5%，分離膠質(zhì)量濃度12%，電泳結(jié)束后用考馬斯亮蘭R-250染色1 h，然后脫色，分析蛋白質(zhì)的表達以及相對分子質(zhì)量的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氯喹啉酸降解菌形態(tài)特征及生理生化特性

通過富集篩選的方法，得到 1株二氯喹啉酸降解菌，命名WK1。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，菌落邊緣整齊，白色，光滑，接種環(huán)易挑起，易拉成絲，革蘭氏染色陰性。能夠水解淀粉，葡萄糖產(chǎn)酸，硝酸鹽還原測試陽性，吲哚和甲基紅試驗為陰性。

圖1 菌株WK1在LB培養(yǎng)基中菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain WK1 in LB medium

2.2 菌株WK1系統(tǒng)發(fā)育鑒定

通過NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)核酸序列比對，菌株WK1的16S rDNA序列和克雷伯氏菌(Klebsiella)DSM 30104菌株(GenBank Accession No.NR 11471.1)的相似度為99.9%。在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚類于同1個分支?；诨蛐蛄泻拖到y(tǒng)進化分析，將菌株WK1鑒定為克雷伯氏菌(Klebsiella)。

圖2 菌株WK1革蘭氏染色圖 (×100)Fig.2 Gram staining figure of strain WK1(×100)

2.3 菌株WK1的生長曲線和對二氯喹啉酸的降解曲線

從圖4可以看出，菌株WK1可以將二氯喹啉酸作為唯一碳源生長。菌株接種到培養(yǎng)基中，前期由于菌株處于延遲期，數(shù)量較低，二氯喹啉酸的質(zhì)量濃度變化不大。當進入對數(shù)期之后，細菌數(shù)量增多，代謝旺盛，質(zhì)量濃度下降快。當細菌處于穩(wěn)定期后，二氯喹啉酸的質(zhì)量濃度不再發(fā)生明顯變化時，二氯喹啉酸降解率達到40.9%。

2.4 菌株WK1降解二氯喹啉酸影響因素分析

2.4.1 接種量對菌株WK1降解二氯喹啉酸的影響 從圖5可以看出，二氯喹啉酸的降解率隨著接種量的增加而增加。當接種量在質(zhì)量分數(shù)為2%時，菌株經(jīng)過5 d培養(yǎng)還處于對數(shù)期，細菌數(shù)量較少，

圖3 菌株WK1的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 菌株WK1對二氯喹啉酸的降解和生長曲線

所以對二氯喹啉酸的降解也較小。當菌株接種量質(zhì)量分數(shù)由5%增加到10%時，接種量的增加并沒有明顯增加二氯喹啉酸的降解率，這是因為經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，菌株都達到了平穩(wěn)期，對二氯喹啉酸的降解率都在35%左右，所以選擇質(zhì)量分數(shù)5%作為試驗的接種量。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05). The same as below. 圖5 接種量對菌株WK1降解二氯喹啉酸的影響

2.4.2 二氯喹啉酸初始質(zhì)量濃度對菌株WK1降解二氯喹啉酸的影響 從圖6可以看出，克雷伯氏菌WK1在不同濃度中均能生長，說明該菌有良好的耐受性。二氯喹啉酸初始質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時，克雷伯氏菌WK1對二氯喹啉酸的降解效果最好，降解率為38.1%。當二氯喹啉酸質(zhì)量濃度超過100 mg·L-1時，克雷伯氏菌WK1的降解率下降，推測是高質(zhì)量濃度的二氯喹啉酸對克雷伯氏菌WK1產(chǎn)生毒害，影響了菌體生長代謝，從而導(dǎo)致二氯喹啉酸的降解率下降。

圖6 二氯喹啉酸初始濃度對菌株WK1降解 二氯喹啉酸的影響

2.4.3 溫度對菌株WK1降解二氯喹啉酸的影響 由圖7可知，溫度對克雷伯氏菌WK1降解二氯喹啉酸的影響相對較大，隨著溫度的升高，菌株對二氯喹啉酸的降解率增大。溫度在35 ℃時，降解率最大，為38.7%；溫度超過35 ℃后，菌株降解能力下降，隨著溫度增加降解率明顯降低；溫度為45 ℃時，降解率最低為18.9%。

圖7 不同溫度對菌株WK1降解二氯喹啉酸影響

2.4.4 pH值對菌株WK1降解二氯喹啉酸的影響 由圖8可知，該菌可以在pH值為4～9的范圍內(nèi)降解二氯喹啉酸，克雷伯氏菌WK1對二氯喹啉酸的降解效果在pH值6～8之間較好。pH值為8時，二氯喹啉酸的降解率達到最大值，降解率為39.7%。pH的增大或減小都會影響菌株對二氯喹啉酸的降解，pH值為4時最差，降解率僅為10%，說明該菌適宜在中性或微堿性的環(huán)境中生長。

圖8 初始pH值對菌株WK1降解二氯喹啉酸的影響Fig.8 Effects of initial pH value on degradation of quinclorac by strain WK1

2.5 菌株WK1降解二氯喹啉酸的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定菌WK1降解二氯喹啉酸的最佳條件。試驗結(jié)果如表2所示。菌株WK1降解效果最好為第6組，即在pH值為8，接種量為6%，二氯喹啉酸初始質(zhì)量濃度為90 mg·L-1，溫度為35 ℃時對二氯喹啉酸的降解率為42%。通過表2中的極差R，可知影響菌株降解二氯喹啉酸的主要因素是pH值，其次是溫度，然后是二氯喹啉酸的初始質(zhì)量濃度和接種量。

表2 正交試驗結(jié)果

2.6 二氯喹啉酸脅迫對降解菌的影響

2.6.1 二氯喹啉酸脅迫對胞內(nèi)蛋白的影響 圖9是2種處理下的菌體胞內(nèi)蛋白的SDS-PAGE圖譜。菌株WK1受到二氯喹啉酸脅迫后蛋白表達出現(xiàn)了差異。對照組在大約20.0、30.0、45.0、56.0 kD的條帶處，有大量的特異性蛋白表達。其中在30.0、56.0 kD處的條帶最為明顯。與處理組相比較，處理組在96.0、35.1、25.0 kD的條帶處，蛋白條帶減少，說明菌體蛋白表達受到抑制。

注：1,Mark; 2、3、4，對照組；5、6、7處理組。Note: 1, Mark; 2, 3 and 4, control groups; 5, 6 and 7, treatment groups. 圖9 菌體胞內(nèi)蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.9 SDS-PAGE map of intracellular protein

2.6.2 二氯喹啉酸脅迫對胞外蛋白的影響 圖10為克雷伯氏菌WK1在2種處理下的胞外蛋白SDS-PAGE圖譜?？死撞暇鶺K1在受到二氯喹啉酸的脅迫下胞外分泌蛋白出現(xiàn)了差異。處理組在31.0 kD的條帶處，有大量特異性蛋白表達，這和胞內(nèi)蛋白表達增加的大小相接近。對照組14.5、35.0 kD的條帶出，蛋白條帶減少，說明菌體減少了在胞外蛋白的表達和分泌。

3 結(jié)論與討論

本研究在農(nóng)藥廠污泥中分離得到降解菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測試，以及16S rDNA同源性分析，鑒定菌株WK1為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)?？死撞暇菑V泛分布于空氣，水，土壤和人的腸道以及呼吸道中的革蘭氏陰性菌。研究發(fā)現(xiàn),該菌群具有多種特殊功能，除了能引起人和家畜的肺炎外，還可以治理水體中的鉻污染。徐淑霞等[19]分離發(fā)現(xiàn)了1株高效還原Cr(Ⅵ)的菌株，鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，該菌對質(zhì)量濃度為70 mg·L-1的Cr(Ⅵ)離子的還原率可達92%。

注：1，Mark；2、3，對照組；4、5，處理組。

本研究表明菌株WK1能以二氯喹啉酸為碳源生長，對二氯喹啉酸有較高的耐受性。通過正交試驗優(yōu)化了菌株降解二氯喹啉酸的條件，在pH 值為8、菌株接種量為6%、溫度為35 ℃條件下，對初始質(zhì)量濃度為90 mg·L-1二氯喹啉酸的降解率最大為42%。降解菌對二氯喹啉酸的降解效率與多種因素有關(guān)，包括二氯喹啉酸初始質(zhì)量濃度、接種菌量、降解條件以及菌株自身降解能力。張順等[12]報道1株節(jié)桿屬菌株MC-10對初始質(zhì)量濃度為20 mg·L-1二氯喹啉酸的降解率在90%以上。周挺等[14]報道1株寡養(yǎng)單胞菌J03對初始質(zhì)量濃度在5 mg·L-1二氯喹啉酸的降解率為33.5%。此類菌株在降解過程中二氯喹啉酸初始質(zhì)量濃度較低，而本研究中菌株WK1可以在二氯喹啉酸初始質(zhì)量濃度較高的環(huán)境中對二氯喹啉酸進行降解，適用于較為極端的條件，實用性更強。土壤的酸堿度能夠影響二氯喹啉酸的降解，二氯喹啉酸在酸性土壤中比較穩(wěn)定，解離度小，不容易被降解，在堿性土壤中解離度大，容易被降解[20]。菌株WK1在pH為8時降解率最高，對二氯喹啉酸的降解率在弱堿性條件比酸性條件高，這與董俊宇[9]等發(fā)現(xiàn)的降解菌J3在弱酸性和中性條件下有較高的降解率有所不同。土壤的酸堿度會影響微生物的影響代謝，所以菌株WK1適合處理中性或弱堿性土壤中的二氯喹啉酸殘留問題。

目前，關(guān)于二氯喹啉酸降解菌的研究大多集中在其降解特性上，對于其降解機制的研究較少。李子木等[21]研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸雙加氧酶是和氯化鄰苯二酚1,2-雙加氧酶在二氯喹啉酸降解發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過在SDS-PAGE檢測了在二氯喹啉酸的脅迫下菌體蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)蛋白表達出現(xiàn)了明顯的差異。這可能與菌體緩解迫害有關(guān)，也有可能與二氯喹啉酸的降解有關(guān)。56.0 kD條帶和鄰苯二甲酸雙加氧酶相對分子質(zhì)量大小相吻合，該條帶的具體蛋白需要進一步確定。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是生物清除活性氧的重要組成部分，可以使細胞降低活性氧的傷害，不同微生物緩解活性氧的機制是不相同[22]。菌體在受到二氯喹啉酸脅迫蛋白表達差異出現(xiàn)在30.0 kD左右，而超氧化物歧化酶相對分子質(zhì)量大小也在30.0 kD，這可能是菌株在受到二氯喹啉酸迫害的緩解方式。