潤膚止癢乳膏對(duì)特應(yīng)性皮炎患者及小鼠模型皮膚屏障功能影響研究

陳志偉，張亞男，陳信春

（1.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江溫州325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310000）

皮膚屏障功能的完整性與特應(yīng)性皮炎（AD）的嚴(yán)重程度有著密切聯(lián)系，潤膚止癢乳膏對(duì)AD小鼠模型皮損有很好的改善作用[1]，故而其能否修復(fù)AD的皮膚屏障值得探討。以往研究表明：角質(zhì)層含水量及經(jīng)表皮水分丟失（TEWL）為反映皮膚屏障功能完整性的重要參數(shù)；神經(jīng)酰胺（Cer）、絲聚蛋白（Filaggrin）含量增加可降低TEWL、提高角質(zhì)層含水量。本研究旨在探索潤膚止癢乳膏對(duì)AD患者及小鼠模型的皮膚屏障修復(fù)作用及機(jī)制[2]。

1 材料與方法

1.1 材料 50只健康BALB/c小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（30±2）g（由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）；潤膚止癢乳膏、基礎(chǔ)乳膏為溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑中心提供（潤膚止癢乳膏主要藥物成份為白及、丹皮、馬齒莧、甘草）；絲塔芙乳膏（高德美加拿大公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20170221）；試劑：小鼠銅藍(lán)蛋白（CER）（源葉生物），引物合成（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），核酸染料（賽百盛GoldView），F(xiàn)ilaggrin（USCN 公司），β-Actin（北京中杉）；皮膚參數(shù)檢測(cè)設(shè)備（意大利Callger soft 5.5六參數(shù)皮膚測(cè)試儀）。

1.2 臨床試驗(yàn)

1.2.1 病例選擇 符合AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，且皮損特征符合慢性皮炎特征：斑片色暗紅，抓痕、鱗屑、干燥、粗糙、苔蘚樣變；1周內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素。

1.2.2 試驗(yàn)方法 將105例符合標(biāo)準(zhǔn)的患者采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組35例，3組患者分別外用潤膚止癢乳膏（潤膚止癢乳膏組）、基礎(chǔ)乳膏（基礎(chǔ)乳膏組）、絲塔芙乳膏（絲塔芙乳膏組），2次/d，共使用12周。

1.2.3 皮膚屏障功能測(cè)定 患者靜坐30 min后開始測(cè)試并控制測(cè)試環(huán)境穩(wěn)定（20℃≤室溫≤25℃；45%≤濕度≤65%），測(cè)其皮損處角質(zhì)層含水量及TEWL，處每項(xiàng)指標(biāo)均檢測(cè)3次，取均值。測(cè)試時(shí)間為：用藥前、用藥12周。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 模型鼠準(zhǔn)備 于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)小鼠，保持恒溫恒濕的清潔環(huán)境。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。觀察其飲食、飲水正常，且無妊娠。1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：空白組、模型組、潤膚止癢乳膏組、基礎(chǔ)乳膏組和絲塔芙乳膏組。實(shí)驗(yàn)前7 d用8%硫化鈉溶液在小鼠背部選取2 cm×2 cm大小皮膚涂擦脫去體毛，將丙酮與橄欖油按3∶1混合，使用混合溶液將二硝基氟苯（DNFB）配置成0.5%濃度。實(shí)驗(yàn)開始第1天與第2天使用0.5% DNFB進(jìn)行小鼠皮損致敏與激發(fā)，于脫背部毛區(qū)各涂擦 1 次/d，100 μL/次，第 3～6 天不涂藥，第 7 天起每隔2 d用70 μL涂擦1次，第28天觀察小鼠皮膚是否出現(xiàn)紅斑、脫屑、苔蘚樣變等臨床表現(xiàn)，若有表示造模完成?？瞻捉M脫毛處理后正常飼養(yǎng)，不作干預(yù)。

1.3.2 干預(yù)方法 5組小鼠除空白組、模型組不作干預(yù)外，其余3組分別在脫毛區(qū)使用潤膚止癢乳膏、基礎(chǔ)乳膏、絲塔芙乳膏，劑量均為100 μL/次，1次/d，連續(xù)使用2周。

1.3.3 指標(biāo)檢測(cè)方法 ①造模完成后隨機(jī)選取模型組小鼠2只處死，取下背部脫毛處的皮膚（不含皮下脂肪）用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察組織病理改變。②干預(yù)結(jié)束后，將動(dòng)物處死，取下背部皮膚并將組織絞碎，-80℃保存。用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)Cer含量，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和West Blot法檢測(cè)Filaggrin基因的表達(dá)和蛋白的含量。

2 結(jié)果

2.1 臨床試驗(yàn) 用藥前，潤膚止癢乳膏組與基礎(chǔ)乳膏組、絲塔芙乳膏組比較，基礎(chǔ)乳膏組與絲塔芙乳膏組比較，角質(zhì)層含水量、TEWL差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；用藥12周后，潤膚止癢乳膏組與基礎(chǔ)乳膏組、絲塔芙乳膏組比較，角質(zhì)層含水量明顯升高（t=4.16、2.95，均 P<0.01），TEWL 明顯降低（t=3.22、2.86，均P<0.01）；基礎(chǔ)乳膏組與絲塔芙乳膏組比較，角質(zhì)層含水量升高不明顯（t=0.97，P>0.05），TEWL 降低不明顯（t=1.03，P>0.05）；潤膚止癢乳膏組、基礎(chǔ)乳膏組、絲塔芙乳膏組角質(zhì)層含水量較用藥前均增加（t=9.43、6.34、6.02，均 P<0.00），TEWL 明顯降低（t=10.16、5.82、6.51，均 P<0.00）。見表 1。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1 皮損表現(xiàn) 造模成功后，小鼠背部皮膚表現(xiàn)為紅斑、苔蘚樣變、脫屑、結(jié)痂等AD皮損改變見圖1，空白組皮膚表現(xiàn)見圖2。

表1 3組治療前后角質(zhì)層含水量、TEWL變化情況 （±s）

表1 3組治療前后角質(zhì)層含水量、TEWL變化情況 （±s）

注：用藥前3組兩兩比較，#P>0.05；與同組治療前比較*P<0.00；與潤膚止癢乳膏組比較，△P<0.01；與基礎(chǔ)乳膏組比較，▲P>0.05。

T E W L（g/h·c m 2）潤膚止癢乳膏組 3 5用藥前 1 8.7 3±3.6 5# 3 2.4 1±5.3 5#用藥1 2周 3 3.4 1±5.9 3* 1 7.3 5±3.6 1*基礎(chǔ)乳膏組 3 5 用藥前 1 8.6 0±3.5 2# 3 2.6 7±5.4 8#用藥1 2周 2 5.1 2±4.3 6*△ 2 1.4 2±4.3 7*△絲塔芙乳膏組 3 5 用藥前 1 8.9 2±3.7 4# 3 2.3 3±5.2 6#用藥 1 2周 2 7.5 8±4.7 2*△▲ 2 1.8 5±4.4 5*△▲組別 n 角質(zhì)層含水量（%）

圖1 AD皮損改變

圖2 空白組皮膚表現(xiàn)

2.2 皮膚組織病理變化 送檢模型組：角質(zhì)層可見角化過度或角化不全、有漿液性滲出；棘層可見細(xì)胞增厚、細(xì)胞內(nèi)水腫及海綿水腫，基底層可見液化變性；真皮層血管周圍見淋巴細(xì)胞浸潤，有明顯紅細(xì)胞外溢出；符合AD皮膚組織病理學(xué)改變。

圖3 模型組皮膚病理改變 （HE染色×400）

2.3 各組Cer含量、Filaggrin基因、Filaggrin蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，模型組Cer、Filaggrin基因、Filaggrin蛋白含量均明顯下降（均P<0.01）；基礎(chǔ)乳膏、絲塔芙乳膏及潤膚止癢乳膏均可增加模型鼠皮損處Cer、Filaggrin基因Filaggrin蛋白含量（均P<0.05）。各治療組間比較：潤膚止癢乳膏在升高模型鼠皮損處Cer、Filaggrin mRNA上與其他2組比較有優(yōu)勢(shì)（均P<0.05）；絲塔芙乳膏、基礎(chǔ)乳膏在升高各指標(biāo)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）；各治療組在升高Filaggrin蛋白含量上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見表 2、圖 4。

表2 各組Cer含量、Filaggrin基因、Filaggrin蛋白表達(dá)情況 （±s）

表2 各組Cer含量、Filaggrin基因、Filaggrin蛋白表達(dá)情況 （±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與基礎(chǔ)乳膏組、絲塔芙乳膏組比較△P<0.05；與基礎(chǔ)乳膏組比較，▲P>0.05；與基礎(chǔ)乳膏組比較☆P>0.05；與絲塔芙乳膏組比較★P>0.05。

F i l a g g r i n基因表達(dá)含量空白組 1 0 8 1.3 4±2 3.4 1 1.0 0±0.1 2模型組 8 1 5.8 1±1 0.5 4* 0.0 4±0.0 1*基礎(chǔ)乳膏組 1 0 1 8.6 7±1 1.7 2# 0.1 0±0.0 1#絲塔芙乳膏組 1 0 2 1.3±9.1 0#▲ 0.1 3±0.0 3#▲潤膚止癢乳膏組 1 0 3 6.7 6±1 8.6 7#△ 0.2 9±0.0 4#△組別 n C e r含量（μ g/m L）F i l a g g r i n蛋白表達(dá)含量1.5 5±0.0 1 0.7 4±0.0 5*1.0 9±0.0 5#1.2 7±0.0 2#▲☆1.3 3±0.0 1#☆★

圖4 Filaggrin蛋白電泳圖

3 討論

AD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，有學(xué)者認(rèn)為該病與皮膚屏障功能損傷有關(guān)，TEWL是皮膚通透屏障中較為重要的指標(biāo)，其表示經(jīng)皮膚向外界擴(kuò)散的水份。在AD患者中，TEWL會(huì)明顯升高、角質(zhì)層含水量則明顯降低[2]。Cer為表皮脂質(zhì)的重要組成部分，而表皮脂質(zhì)起到儲(chǔ)水保濕的功效，從而維持正常的皮膚屏障功能[4]。國外研究也表明表皮中Cer含量的高低與AD皮損的嚴(yán)重程度有關(guān)[5]。有學(xué)者通過臨床觀察證實(shí)：AD患者表皮中Cer含量明顯降低，通過保濕劑干預(yù)后其Cer含量顯著上升[6]。Filaggrin為構(gòu)成角質(zhì)層的重要蛋白，研究表明該蛋白缺失會(huì)破壞皮膚屏障，TEWL加快，從而引起皮膚干燥并增加過敏原的暴露機(jī)會(huì)[7]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)AD患者皮損區(qū)中角質(zhì)層與顆粒層Filaggrin含量偏低[8]。也有研究顯示，AD患兒無論皮損還是周圍外觀正常的皮膚，其Filaggrin蛋白表達(dá)均有下降[9]。AD患者中Filaggrin蛋白的低含量與缺氧誘導(dǎo)因子干預(yù)下基因的低表達(dá)密切相關(guān)[10]。

潤膚止癢乳膏成分中，馬齒莧有著清熱解毒、涼血止血功效，且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其鮮榨汁外敷可以升高濕疹模型大鼠皮損中Filaggrin蛋白含量[11]；白及能收斂止血，消腫生肌，有臨床觀察顯示外用含有白及成分的乳膏制劑可以顯著降低角化性濕疹患者的瘙癢程度及皮損面積[12]。也有實(shí)驗(yàn)表明，含有白及的中藥洗劑對(duì)皮炎濕疹類疾病療效較好[13]。牡丹皮清熱涼血，活血祛瘀，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，含有丹皮酚成分的乳液可以修復(fù)AD小鼠模型受損的皮膚屏障[14]。甘草可以清熱解毒，臨床觀察證實(shí)，復(fù)方甘草油外用對(duì)AD有效[15]。諸藥共奏養(yǎng)血潤膚止癢之功。

該研究表明，AD患者在經(jīng)潤膚止癢乳膏治療后可以降低TEWL，增加角質(zhì)層含水量，從而達(dá)到修復(fù)皮膚屏障的作用，基礎(chǔ)乳膏與絲塔芙乳膏也有相似作用，但二者效果均不及潤膚止癢乳膏。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以看出，潤膚止癢乳膏可以增加模型鼠皮損中的Cer含量，促進(jìn)Filaggrin基因的表達(dá)增加Filaggrin蛋白含量，通過如上機(jī)制來修復(fù)受損的皮膚屏障；而基礎(chǔ)乳膏、絲塔芙乳膏作用與之相仿，但潤膚止癢乳膏在增加Cer含量、促進(jìn)Filaggrin基因的表達(dá)上優(yōu)勢(shì)明顯。