miR-299-5p靶向RRS1調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的分子機(jī)制

郭令飛 羅德紅 葛華 王燦

(遵義市第一人民醫(yī)院 1胃腸外科，貴州 遵義 563000；2腫瘤科)

從分子水平探究胃癌發(fā)生進(jìn)展過(guò)程相關(guān)的作用靶點(diǎn)對(duì)提高治療效果及改善患者預(yù)后均具有重要臨床意義〔1〕。研究顯示微小RNA(miRNA)可參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生物學(xué)過(guò)程〔2〕。miRNA-299-5p在甲狀腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，上調(diào)miRNA-299-5p表達(dá)后可抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲〔3,4〕。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)核糖體合成調(diào)控因子(RRS)1是miRNA-299-5p的靶基因，RRS1廣泛分布于真核細(xì)胞且屬于一種細(xì)胞核蛋白，同時(shí)可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)分泌及核糖體合成等生理過(guò)程〔5〕。相關(guān)研究報(bào)道，敲低RRS1基因后，核糖體蛋白R(shí)PL11釋放量增加且與E3泛素連接酶(MDM)2結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)p53蛋白合成最終促使腫瘤細(xì)胞凋亡〔6〕。但miRNA-299-5p與RRS1在胃癌中作用的研究相對(duì)較少，本研究擬分析miRNA-299-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其可能作用機(jī)制，并證實(shí)miRNA-299-5p與RRS1的靶向關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胃癌細(xì)胞株BGC-823、MKN45、MGC803與正常胃上皮細(xì)胞株GES-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-299-5p mimic及其陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；RRS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-RRS1)、對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA)、野生型及突變型RRS1基因3′UTR熒光素酶表達(dá)載體均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RRS1 siRNA(si-WWOX)與陰性對(duì)照siRNA(si-NC)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；miR-299-5p抑制劑(anti-miR-299-5p)與anti-miR-NC均購(gòu)自上海賓智生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RRS1抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；SYBR Green熒光染料試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 人胃癌細(xì)胞株BGC-823、MKN45、MGC803與正常胃上皮細(xì)胞株GES-1均采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)，放入恒溫培養(yǎng)箱，每隔2 d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～5 d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集細(xì)胞，胰酶消化后接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至50%～60%時(shí)更換不含胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(miR-NC)與miR-299-5p組，其中miR-NC組將miR-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞；miR-299-5p組將miR-299-5p mimic轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為正常RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將miR-NC質(zhì)粒與si-RRS1轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞分別作為miR-NC組、si-RRS1組，轉(zhuǎn)染及處理方法同上。為了證實(shí)miR-299-5p是通過(guò)抑制RRS1表達(dá)調(diào)控BGC-823細(xì)胞增殖及凋亡，將miR-299-5p mimic與pcDNA-RRS1共同轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞，檢測(cè)RRS1是否可逆轉(zhuǎn)miR-299-5p抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將分為miR-299-5p+pcDNA組、miR-299-5p+pcDNA-RRS1組，轉(zhuǎn)染及處理方法同上。

1.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-299-5p及RRS1 mRNA表達(dá) 根據(jù)Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取各組BGC-823細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA，以cDNA為模板并參照SYBR Green熒光染料試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，循環(huán)反應(yīng)40次，循環(huán)條件為：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。miR-299-5p以U6為內(nèi)參基因，RRS1以GAPDH為內(nèi)參基因，收集并分析數(shù)據(jù)Ct值，采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-299-5p、RRS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)水平 收集各組BGC-823細(xì)胞，置于冰上加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA定量，各組蛋白(樣品量60 μg)均進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將已分離蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉，90 min后加入RRS1(1∶500)蛋白一抗，Tis-HCI緩沖液(TBST)清洗3次，5 min/次，加入二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，10 min/次，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影，置于凝膠成像系統(tǒng)觀察各條帶并應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 分別收集miR-NC組、miR-299-5p組、miR-299-5p+pcDNA組、miR-299-5p+pcDNA-RRS1組、si-NC組、si-RRS1組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，胰酶消化后接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔，于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)分別加入10 μl/孔MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，分別加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值即為細(xì)胞增殖活力，每組均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h后各組BGC-823細(xì)胞，采用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入結(jié)合緩沖液1 ml沖洗1次，放入離心機(jī)離心后棄上清，分別在各組細(xì)胞中加入結(jié)合緩沖液200 μl，混勻，加入5 μl碘化丙錠(PI)與5 μl Annexin V-FITC，室溫孵育20 min，分別加入結(jié)合緩沖液400 μl，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組BGC-823細(xì)胞凋亡率。

1.7熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-299-5p靶基因 通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)RRS1是miR-299-5p的靶基因，構(gòu)建野生型與突變型基因靶點(diǎn)RRS1 3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-3′URT、MUT-3′UTR)，分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)細(xì)胞/孔，細(xì)胞融合至60%左右時(shí)分別將空載體、WT-3′UTR、 MUT-3′UTR轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞，同步轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic或miR-NC，統(tǒng)計(jì)熒光素酶與Renilla活性比值，嚴(yán)格按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-299-5p和RRS1在胃癌BGC-823、MKN45、MGC803細(xì)胞和正常胃上皮細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，相較于正常胃上皮細(xì)胞GES-1，胃癌BGC-823、MKN45、MGC803細(xì)胞中miR-299-5p表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，RRS1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，BGC-823、MKN45、MGC803細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)水平顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表1。BGC-823細(xì)胞中miR-299-5p表達(dá)水平最低，因此后續(xù)研究中將采用BGC-823細(xì)胞為主要研究細(xì)胞。

圖1 RRS1蛋白表達(dá)

表1 miR-299-5p和RRS1在胃癌BGC-823、MKN45、MGC803細(xì)胞和正常胃上皮細(xì)胞GES-1中的表達(dá)

2.2miR-299-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于miR-NC組，miR-299-5p組BGC-823細(xì)胞miR-299-5p表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic后，在48 h與72 h miR-299-5p組BGC-823細(xì)胞增殖活力顯著低于miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 miR-299-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響

2.3miR-299-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic的miR-299-5p組BGC-823細(xì)胞凋亡率〔(25.69±2.33)%〕顯著高于miR-NC組〔(8.13±0.82)%；t=12.313,P=0.000〕，見(jiàn)圖2。

圖2 細(xì)胞凋亡流式圖

2.4抑制RRS1表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖和凋亡的影響 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-RRS1后胃癌BGC-823細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)水平顯著低于si-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。MTT與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-RRS1組BGC-823細(xì)胞增殖活力在48、72 h顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖3 轉(zhuǎn)染si-RRS1后胃癌BGC-823細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)

表3 抑制RRS1表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5miR-299-5p靶向調(diào)控RRS1的表達(dá) 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)BGC-823細(xì)胞RRS1基因miR-299-5p定位序列結(jié)果顯示，miR-299-5p在RRS1基因3′UTR具有相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-RRS1后，再轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic BGC-823細(xì)胞的熒光素酶活性(0.42±0.04)較再轉(zhuǎn)染miR-NC組(1.01±0.09)顯著降低(t=10.376，P=0.001)；轉(zhuǎn)染MUT-RRS1后，再轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic BGC-823細(xì)胞的熒光素酶活性(1.03±0.09)與miR-NC組(1.04±0.08)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.144,P=0.893)。進(jìn)一步采用Western印跡驗(yàn)證miR-299-5p與RRS1基因的作用關(guān)系，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic后BGC-823細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)水平(0.21±0.03)相較于miR-NC組(0.72±0.07)顯著降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-299-5p抑制劑(anti-miR-299-5p)后BGC-823細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)水平(1.05±0.09)顯著高于anti-miR-NC組(0.68±0.06，P<0.05)，見(jiàn)圖5。

1～4：miR-NC組,miR-299-5p組,anti-miR-NC組,anti-miR-299-5p組圖5 各組RRS1蛋白表達(dá)

2.6RRS1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-299-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖和凋亡的作用 共轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic與RRS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-RRS1的miR-299-5p+pcDNA-RRS1組BGC-823細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)水平較miR-299-5p+pcDNA組顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6。miR-299-5p+pcDNA-RRS1組BGC-823細(xì)胞增殖活力在48、72 h較miR-299-5p+pcDNA組顯著升高(P<0.05)；而miR-299-5p+pcD-NA-RRS1組BGC-823細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

1～4：miR-NC組,miR-299-5p組,miR-299-5p+pcDNA組,miR-299-5p+pcDNA-RRS1組圖6 共轉(zhuǎn)染miR-299-5p mimic后RRS1蛋白表達(dá)

表4 RRS1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-299-5p過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

胃癌發(fā)生過(guò)程涉及多種信號(hào)通路，挖掘胃癌表觀遺傳學(xué)變化成為探究發(fā)病機(jī)制的主要手段，編碼基因或非編碼基因異常變化均可促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展〔7〕。miRNA作為內(nèi)源性非編碼RNA，其可通過(guò)調(diào)控下游靶基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)或抑制胃癌發(fā)生及發(fā)展〔8〕。miR-299-5p在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、胃腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均呈低表達(dá)，并可作為評(píng)估癌癥進(jìn)展及患者預(yù)后的重要分子標(biāo)志物〔9～11〕。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-299-5p可能參與胃癌發(fā)生過(guò)程，提示miR-299-5p可能發(fā)揮抑癌基因作用。另有研究表明，miR-299-5p在肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)，敲低miR-299-5p可有效抑制肝細(xì)胞癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展〔12,13〕。分析原因可能為不同腫瘤細(xì)胞或組織中miR-299-5p表達(dá)變化不同，這可能與腫瘤種類及惡性程度有關(guān)。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-299-5p過(guò)表達(dá)可有效抑制細(xì)胞增殖活力并提高細(xì)胞凋亡水平，提示miR-299-5p表達(dá)水平降低可能導(dǎo)致胃癌發(fā)生。

甲狀腺癌細(xì)胞中RRS1表達(dá)水平升高，采用RNA干擾技術(shù)沉默RRS1基因后甲狀腺癌細(xì)胞增殖率明顯降低〔14〕。乳腺癌細(xì)胞中RRS1呈高表達(dá)并可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔15〕。與上述報(bào)道相似，本研究結(jié)果提示RRS1可能參與胃癌發(fā)生過(guò)程。沉默RRS1表達(dá)可能通過(guò)激活p53信號(hào)通路進(jìn)而引起癌細(xì)胞周期阻滯并促使細(xì)胞凋亡〔16，17〕。通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNAi敲低RRS1可抑制乳腺癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔18,19〕。本研究進(jìn)一步采用RNA干擾技術(shù)降低RRS1表達(dá)，并分析其對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示抑制RRS1表達(dá)后BGC-823細(xì)胞增殖活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似〔20〕。說(shuō)明抑制RRS1表達(dá)與miR-299-5p過(guò)表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞增殖及凋亡的作用相同，miR-299-5p與RRS1可能存在負(fù)向調(diào)控作用。提示RRS1表達(dá)水平升高可通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制其凋亡進(jìn)而促進(jìn)胃癌發(fā)生及發(fā)展。本研究結(jié)果顯示RRS1是miR-299-5p的靶基因，經(jīng)Western印跡進(jìn)一步驗(yàn)證miR-299-5p可直接調(diào)控靶基因RRS1表達(dá)。進(jìn)一步驗(yàn)證miR-299-5p是否直接靶向RRS1發(fā)揮作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-299-5p+pcDNA-RRS1組細(xì)胞增殖活力明顯高于miR-299-5p+pcDNA組，細(xì)胞凋亡率顯著降低，分析其可能作用機(jī)制為miR-299-5p表達(dá)水平升高可降低靶基因RRS1表達(dá)進(jìn)而激活p53介導(dǎo)的信號(hào)通路導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡。提示miR-299-5p直接靶向調(diào)控RRS1表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖抑制并促進(jìn)凋亡。