梁文化, 孫旭超, 岳紅亮, 田 錚, 陳 濤, 趙慶勇, 朱 鎮(zhèn), 趙 凌, 趙春芳,姚 姝, 路 凱, 王才林, 張亞東

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術研究中心/國家水稻改良中心南京分中心,江蘇 南京 210014)

水稻粒型包括粒長、粒寬和粒厚等3個基本要素,是影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的重要農(nóng)藝性狀[1-2],因此粒型基因的發(fā)掘和利用一直倍受重視。目前人們已經(jīng)在水稻中定位了400多個與粒型相關的數(shù)量性狀座位(Quantitative trait locus, QTL),克隆的粒型基因已經(jīng)超過60個,其中控制粒長的基因有GS3、GL3.1/qGL3、GLW7、TGW3、OsMADS1、GS9等[3-9]，控制粒寬的基因有GW2、GW5/qSW5、GS5、GW7/GL7、GW8等[10-16]，控制粒厚的基因有WTG1[17-18]。以上研究結(jié)果證實,通過調(diào)節(jié)水稻的籽粒性狀可以增加水稻千粒質(zhì)量,從而提高水稻產(chǎn)量。

GS3是水稻中控制粒長、粒質(zhì)量的重要基因,對粒寬、粒厚也有一定影響,全長的GS3基因編碼1個跨膜蛋白,是G蛋白的γ亞基之一,在水稻幼穗中高表達[3,19-20]。qGL3/GL3.1基因編碼含有2個Kelch功能域的蛋白磷酸酶OsPPKL1,在幼穗中表達量較高,通過調(diào)控細胞周期蛋白T1;3來控制穎殼的細胞分裂,最終影響水稻籽粒大小[4-5]。GW2是控制水稻粒寬和粒質(zhì)量的主效基因,在水稻各組織中都表達,該基因編碼1個環(huán)型E3泛素連接酶,通過泛素介導的蛋白質(zhì)降解途徑負調(diào)控細胞分裂[10]。qSW5/GW5基因編碼鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,對水稻粒寬、粒質(zhì)量有顯著影響，qSW5/GW5基因在水稻各個組織、器官中都表達,在幼穗中表達量最高[11-12,21]。GS5基因是控制水稻粒寬、粒質(zhì)量和充實度的主效QTL,在幼穗中表達量較高,通過促進外稃/內(nèi)稃細胞分裂和細胞膨脹而正調(diào)控水稻籽粒的大小[13,22]。GW7/GL7基因編碼擬南芥LONGIFOLIA蛋白的同源蛋白,在水稻幼穗和分生組織中高表達,通過調(diào)控谷粒的細胞分裂而影響粒型[14-15]。GW8是1個SBP(Squamosa promoter binding protein)家族的轉(zhuǎn)錄因子,在7 cm長的水稻幼穗中表達量最高,該基因的高表達會促進細胞增殖和籽粒灌漿,從而使籽粒變寬,進而提高產(chǎn)量,GW8基因與GW7基因的啟動子結(jié)合并抑制GW7基因的表達[16]。

本研究中的水稻材料TD70是來源于天鵝谷///9520//(72-496/蘇御糯)后代粒質(zhì)量超雙親的超大粒穩(wěn)定品系,Kasalath為印度的常規(guī)秈稻品種,2012年正季在南京種植的TD70千粒質(zhì)量為65.0 g,Kasalath千粒質(zhì)量為17.4 g[23]。在前期的研究中,筆者利用TD70與小粒秈稻Kasalath構(gòu)建了重組自交系(RIL)群體,共檢測到19個穩(wěn)定遺傳的粒型相關QTL,這些QTL區(qū)間包含GS3、qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS5、GW7及GW8共7個已克隆的粒型基因位點,遺傳效應分析結(jié)果表明,TD70中這些粒型基因位點對水稻籽粒大小具有正向作用,Kasalath中不含有這些粒型基因的增效位點；進一步研究發(fā)現(xiàn),TD70中不同粒型的基因組合對籽粒大小具有累加效應[24-26]。由此可見,多個粒型基因的聚合是TD70具有超大籽粒的原因,然而在多個粒型基因聚合后,水稻孕穗期幼穗表達譜中穗發(fā)育相關基因的表達和代謝通路的變化并不清晰。

近年來,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術已經(jīng)成為研究表達譜的有力工具,研究者利用RNA-Seq技術在水稻的育性、穗發(fā)育、耐鹽、耐熱等方面展開了相關研究[27-33]。為了研究水稻粒型相關基因孕穗期在幼穗發(fā)育中的調(diào)控機制,本研究對超大粒粳稻TD70和小粒秈稻Kasalath孕穗期不同階段的幼穗進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過對差異表達基因的基因本體(Gene ontology, GO)富集和代謝通路的分析,從基因表達水平、代謝通路的變化方面對大粒水稻品種形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡進行解析,以期為在水稻育種中高效利用粒型基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料的種植與取樣

大粒粳稻品系TD70為天鵝谷///9520//(72-496/蘇御糯)的后代,是本研究團隊自主創(chuàng)制的穩(wěn)定品系；Kasalath是印度的一個常規(guī)秈稻品種,由江蘇省種質(zhì)資源保護與利用平臺提供。以上材料于2018年種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院試驗田中,于2018年5月12日播種,6月12日移栽,每個小區(qū)種植4行,每行10株,株距為13.5 cm,行距為26.5 cm,每個品種種植3個小區(qū),采用常規(guī)栽培和管理措施。研究發(fā)現(xiàn),粒型相關基因在水稻幼穗中的表達比較活躍[5-7]。為了全面分析水稻抽穗前幼穗發(fā)育不同階段表達譜的變化,筆者在水稻孕穗期取3個不同發(fā)育時期的幼穗[分別記作P1(幼穗長度為1～3 cm)、P2(幼穗長度為4～7 cm)、P3(幼穗長度為8～10 cm)]進行轉(zhuǎn)錄組測序,每個時期的樣品取3個生物學重復,共18個幼穗樣本。幼穗樣品分離后立即置于液氮中速凍,于-80 ℃保存至RNA提取。

1.2 成熟種子粒型相關性狀的測定

分別取5株成熟TD70、Kasalath單株的種子。每個單株隨機挑選10粒飽滿的種子,使用游標卡尺(精度為0.01 mm)測量種子粒長、粒寬和粒厚,千粒質(zhì)量(即單株水稻1 000粒風干種子的質(zhì)量)用電子天平(精度0.001 g)測定。每個性狀以5株水稻所測平均值作為最終數(shù)值。

1.3 RNA提取、文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

使用TRIzol?RNA Purification Kit (Invitrogen)對水稻幼穗組織進行總RNA的提取,并用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。使用NanoDrop 2000、Qubit2.0、Agilent 2100分別對RNA進行純度、濃度、完整性檢測。以mRNA為模板,利用AMPure XP beads試劑盒對RNA進行純化、打斷、修復、片段選擇、PCR富集等操作,構(gòu)建cDNA文庫。對于質(zhì)量檢測合格的文庫,由安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司使用Illumina公司的NovaSeq 6000平臺進行測序,測序模式為Paired-end 150 bp。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)下機后,首先用fastQC(Ver 0.11.9)進行測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測與評估；原始測序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量序列,采用軟件fastp(Ver 0.20.0)進行處理,設定參數(shù)保證兩端序列的最小長度均≥50 bp,進而獲得高質(zhì)量的干凈讀長(clean reads)。本研究基于日本晴(Nipponbare)水稻參考基因組(http://plants.ensembl.org/index.html,IRGSP-1.0),按照Trapnell等已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組分析的經(jīng)典流程進行數(shù)據(jù)分析[34]。首先,用軟件包Tophat2(Ver 2.1.1)將得到的clean reads與參考基因組進行比對[34-35],進一步利用Samtools(Ver 1.6)軟件獲得特異性比對結(jié)果[36]。然后,基于Tophat 2比對的結(jié)果,使用Cufflinks(Ver 2.2.1)軟件包進行基因表達量的計算和差異基因的尋找。采用FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)評價每個基因的表達豐度,同時過濾多個樣本中FPKM<1的假陽性轉(zhuǎn)錄本。進一步利用軟件Cuffdiff(Ver 2.2.1)對水稻幼穗不同發(fā)育階段的差異表達基因(Differentially expressed genes, DEGs)進行鑒定,差異表達基因的篩選條件如下：log2(fold change)≥1(fold change代表某個基因在2個材料中的表達量),q值<0.05[34]。將DEGs與美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)網(wǎng)站上的nr蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對,預測其基因功能,然后利用GO、KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能分類和代謝途徑的富集分析。

1.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證

利用qRT-PCR定量技術分析部分差異表達基因的表達豐度。使用Primer Premier(Ver 5.0)軟件進行引物設計,16個基因的引物序列見表1。用與RNA-Seq建庫同批次的RNA進行qRT-PCR驗證。使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix kit (TransGen Biotech)進行cDNA第一鏈合成。定量PCR在ABI Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)上進行,使用的試劑為SYBR PremixExTaqTMRT-PCR kit (TaKaRa)。以水稻基因OsActin-1[基因識別號(ID)：Os03g0718100]作為內(nèi)標,通過相對定量的方法獲得測定值[37]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TD70與Kasalath的粒型分析

研究發(fā)現(xiàn),特大粒水稻品系TD70中聚合了GS3、qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS5、GW7及GW8共7個對籽粒大小具有正向效應的粒型基因；小粒秈稻Kasalath中不含有上述基因[24-26]。于2018年正季測定成熟水稻的籽粒大小,由圖1可以看出,TD70平均粒長11.78 mm,粒寬4.49 mm,粒厚2.99 mm,千粒質(zhì)量66.72 g,其千粒質(zhì)量顯著高于Kasalath(17.94 g)。t檢驗結(jié)果表明,TD70的粒長、粒寬、粒厚及千粒質(zhì)量均高于Kasalath,2份材料之間的差異達到極顯著水平(P<0.01)；而TD70的長寬比則小于Kasalath,二者之間的差異也達到極顯著水平(P<0.01)。由此可見,多個粒型基因的聚合增加了水稻粒長、粒寬和粒厚,從而產(chǎn)生了超大籽粒,進而提高了千粒質(zhì)量。

表1 用于qRT-PCR表達分析的引物序列

A：籽粒形態(tài)特征；B：粒長；C：粒寬；D：粒厚；E：長寬比；F：千粒質(zhì)量；各表型特征圖中的**表示經(jīng)t檢驗,2個材料間存在極顯著差異(P<0.01)。圖1 TD70和Kasalath的籽粒表型特征差異Fig.1 Differences of grains phenotypic characteristics between TD70 and Kasalath

2.2 2個水稻材料幼穗中轉(zhuǎn)錄組測序及序列比對

本研究通過對2個水稻材料的18個水稻幼穗樣本測序文庫進行測序,得到的原始read數(shù)共為857 017 092條,平均每個測序文庫得到47 612 061條原始read。進行去除接頭、去污染和去低質(zhì)量處理后,平均每個測序文庫獲得的clean read數(shù)量為45 474 692條。通過FastQC軟件對clean數(shù)據(jù)的測序質(zhì)量進行檢測,結(jié)果表明,18個測序文庫堿基的Q30(測序堿基準確率為99.9%的read)比例最低為91.9%,最高為93.0%,平均為92.2%,可見測序質(zhì)量較高。利用Tophat軟件包將測序得到的每個clean數(shù)據(jù)回貼到參考基因組中。從表2可以看出,clean數(shù)據(jù)比對到參考基因組的最低概率為83.2%,最高達到90.9%。特異性比對(Unique alignment)到日本晴基因組中唯一位點的概率為74.4%～85.1%,平均為79.9%。TD70比對到參考基因組的概率明顯高于Kasalath,這可能是秈粳稻之間基因組的差異造成的。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及與水稻幼穗中基因組比對

2.3 2個水稻材料幼穗中轉(zhuǎn)錄組的整體分析

為了分析TD70和Kasalath在水稻孕穗期幼穗中表達譜的動態(tài)差異,筆者對至少在1個樣本中表達的基因進行斯皮爾曼相關系數(shù)(Sppanicleman correlation coefficient, SCC)分析和主成分分析(Principal component analysis, PCA)。結(jié)果顯示,每個樣本的3個生物學重復間的最低相關系數(shù)為0. 947 2,說明測序樣本生物學重復具有較好的重現(xiàn)性。從圖2A可以看出,同一水稻材料不同時期的樣本間也存在相關性；2個水稻材料在相同發(fā)育時期的幼穗間存在一定差異；TD70中后期(P2和P3)的幼穗具有一定的相似性而與前期的差異較大,Kasalath也存在類似的情況。由圖2B可以看出,2個水稻材料在早期(P1)幼穗中表達譜具有明顯差異；隨著水稻幼穗的發(fā)育,在中后期(P2、P3)幼穗中表達譜的差異進一步擴大,這暗示2個水稻材料在幼穗發(fā)育早期表達譜已經(jīng)出現(xiàn)差異,可能是造成后期水稻籽粒大小差異的原因。

2.4 2個水稻材料幼穗中差異表達基因分析

根據(jù)Cufdiff的檢測結(jié)果,設定差異表達基因的標準為q<0.05,差異表達倍數(shù)≥2,對TD70與Kasalath不同大小幼穗的3個比較組(TD70-P1/Kasalath-P1、TD70-P2/Kasalath-P2、TD70-P3/Kasalath-P3)進行差異表達基因分析。結(jié)果顯示,P1期有3 618個差異表達基因,其中2 436個基因上調(diào)表達,1 182個基因下調(diào)表達；P2期共獲得4 183個差異表達基因,其中2 368個基因上調(diào)表達,1 815個基因下調(diào)表達；P3期獲得的差異表達基因數(shù)共5 254個,其中2 426個基因上調(diào)表達,2 828個基因下調(diào)表達。由圖3A可見,隨著水稻幼穗的發(fā)育,2個材料間差異表達的基因數(shù)明顯增多,說明后期有更多基因參與到小穗發(fā)育進程中。從差異表達基因文氏圖(圖3B)看出,在3個時期都差異表達的基因有1 742個,在P1、P2、P3時期特異的差異表達基因分別有1 055個、990個、2 096個。說明水稻幼穗在不同發(fā)育時期的差異表達基因既有共性的，也有不同時期特異性的。

A：通過Sppanicleman相關系數(shù)計算3個生物學重復之間的相關性,比例尺中數(shù)據(jù)表示斯皮爾曼相關系數(shù)；B：主成分分析顯示TD70和Kasalath不同發(fā)育階段幼穗的轉(zhuǎn)錄組聚類關系。圖A中，a:K-P1-1;b:K-P1-2;c:K-P1-3;d:K-P2-1;e:K-P2-2;f:K-P2-3;g:K-P3-1;h:K-P3-2;i:K-P3-3;j:T-P1-1;k:T-P1-2;l:T-P1-3;m:T-P2-1;n:T-P2-2;o:T-P2-3;p:T-P3-1;q:T-P3-2;r:T-P3-3。K：Kasalath；T：TD70；P1、P2、P3：孕穗期1～3 cm、4～7 cm、8～10 cm長度的幼穗；1、2、3：樣本的3個生物學重復。圖2 2個水稻材料幼穗發(fā)育不同階段轉(zhuǎn)錄組之間的相關性Fig.2 Correlation between transcriptomes of two rice materials at different young panicles development stages

A：TD70和Kasalath幼穗發(fā)育不同時期差異表達基因統(tǒng)計結(jié)果；B：差異表達基因在水稻幼穗發(fā)育3個時期的分布情況。K：Kasalath；T：TD70；P1、P2、P3：孕穗期1～3 cm、4～7 cm、8～10 cm長度的幼穗；1、2、3：樣本的3個生物學重復。圖3 2個水稻材料幼穗間差異表達基因的統(tǒng)計Fig.3 Statistics of differentially expressed genes between two rice materials

2.5 2個水稻材料幼穗中差異表達基因的qRT-PCR表達驗證

從轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中選取16個基因,包括TD70中已知的7個粒型基因GS3、qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS5、GW7和GW8。利用qRT-PCR分析這些基因在2個水稻材料不同發(fā)育時期幼穗中的相對表達水平,對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行可靠性驗證。圖4顯示,16個基因的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致,表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。同時,對粒型基因在不同發(fā)育時期幼穗中的表達模式進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),qGL3基因在TD70幼穗發(fā)育早期下調(diào)表達,隨著幼穗的發(fā)育,在中后期表現(xiàn)為上調(diào)表達；GW7、GW8基因在TD70幼穗發(fā)育過程中始終上調(diào)表達；其余4個粒型基因在Kasalath 3個幼穗發(fā)育時期的表達水平均高于TD70。由此可見,以上7個粒型基因在2個水稻材料幼穗中具有不同的表達模式,對水稻籽粒發(fā)育調(diào)控的作用和時期亦不同。

A：識別號(ID)為Os03g0646900、Os03g0407400、Os08g0531600、Os05g0187500基因分析；B：識別號(ID)為Os02g0244100、Os07g0603300、Os05g0158500、Os11g0247300基因分析；C：識別號(ID)為Os03g0687700、Os04g0580700、Os09g0309600、Os02g0638650基因分析；D：識別號(ID)為Os06g0147500、Os12g0114800、Os01g0944200、Os03g0712800基因分析。fold change表示某個基因在2個水稻材料幼穗中的表達量。x坐標軸上的1、2、3分別表示比較組T-P1/K-P1、T-P2/K-P2、T-P3/K-P3；T:TD70;K:Kasalath;P1、P2、P3：孕穗期1～3 cm、4～7 cm、8～10 cm長度的幼穗。圖4 2個水稻材料幼穗中差異表達基因的qRT-PCR分析Fig.4 The qRT-PCR analysis of differentially expressed genes in two rice cultivars

2.6 2個水稻材料幼穗中差異表達基因的GO富集與代謝通路分析

生物體內(nèi)生物學功能的行使需要不同基因共同協(xié)調(diào)完成,為了探究差異表達基因的生物學功能,筆者對2個水稻材料3個幼穗發(fā)育時期的差異表達基因(數(shù)量分別為3 618個、4 183個、5 254個)按照GO的3個類別的生物進程(Biological processes, BP)、細胞組分(Cellular components, CC)和分子功能(Molecular functions, MF)進行功能富集分析。結(jié)果顯示,共有4 374個差異表達基因得到注釋，P1、P2和P3這3個時期分別注釋到1 825個(50.44%)、2 267個(54.20%)、2 929個(55.75%)基因。在水稻幼穗發(fā)育的P1階段,代謝進程(GO編號:0008152)、DNA結(jié)合(GO編號:0005488)及細胞進程(GO編號:0005623)分別是生物學進程、分子功能和細胞組分3個類別中富集到最多基因的分組。差異表達基因在生物學途徑中的生物進程調(diào)節(jié)(GO編號:0050789)、信號(GO編號:0023052)、生殖進程(GO編號:0022414)及發(fā)育過程(GO編號:0032502)等二級分類中較為集中。同時,在生長(GO編號:0040007)、細胞增殖(GO編號:0008283)等可能與水稻穎殼大小密切相關的代謝途徑中也有差異表達基因顯著富集。在分子功能方面,差異表達基因主要富集在催化活性(GO編號:0003824)、轉(zhuǎn)運活性(GO編號:0005215)及分子功能調(diào)節(jié)(GO編號:0098772)等功能類別中。在細胞組分方面,膜系統(tǒng)(GO編號:0016020)、細胞器(GO編號:0043226)及蛋白質(zhì)復合體(GO編號:0032991)等細胞代謝相關的重要組分的差異表達基因較多。通過以上GO富集分析發(fā)現(xiàn),在水稻幼穗發(fā)育過程中,基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)的合成與運輸以及信號轉(zhuǎn)導等代謝活動較為活躍。此外,隨著水稻幼穗的生長發(fā)育,富集到的差異表達基因數(shù)量逐漸增加,說明在幼穗發(fā)育后期,生物學進程更加活躍、復雜,因而參與調(diào)控的基因也更多(圖5)。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行代謝通路分析。結(jié)果表明,在水稻的3個幼穗發(fā)育時期分別有217個、258個、332個基因得到注釋,共涉及119條KEGG代謝通路。同一個KEGG中包含10個以上差異表達基因的通路主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路、淀粉和蔗糖代謝通路、激素信號轉(zhuǎn)導通路、氨基酸生物合成通路、碳代謝通路以及核糖體通路等,其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路在水稻的3個幼穗發(fā)育階段都被顯著富集,淀粉和蔗糖代謝通路、碳代謝通路在水稻幼穗發(fā)育后期顯著富集。此外,次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路也富集到大量基因,表明次生代謝產(chǎn)物在水稻幼穗發(fā)育過程中可能也有重要作用(表3)。

A：T-P1/K-P1差異表達基因的GO結(jié)果；B：T-P2/K-P2差異表達基因的GO結(jié)果；C：T-P3/K-P3差異表達基因的GO結(jié)果。T:TD70;K:Kasalath;P1、P2、P3：孕穗期1～3 cm、4～7 cm、8～10 cm長度的幼穗。圖A中，a1:代謝進程；a2:細胞進程；a3:生物調(diào)節(jié)；a4:生物進程調(diào)節(jié)；a5:刺激反應；a6:定位；a7:細胞組分組織或生物發(fā)生；a8:信號；a9:多細胞有機體進程；a10:發(fā)育進程；a11:生物進程正調(diào)節(jié)；a12:多種生物進程；a13:生殖進程；a14:生殖；a15:生長；a16:細胞增殖；b1:DNA結(jié)合；b2:催化活性；b3:轉(zhuǎn)運活性；b4:轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)活性；b5:結(jié)構(gòu)分子活性；b6:分子功能調(diào)節(jié)；b7:抗氧化活性；c1:細胞；c2:細胞部分；c3:膜；c4:膜部分；c5:細胞器；c6:細胞器部分；c7:蛋白質(zhì)復合體；c8:胞外區(qū)；c9:膜封閉腔。圖B中，a1:代謝進程；a2:細胞進程；a3:生物調(diào)節(jié)；a4:生物進程調(diào)節(jié)；a5:刺激反應；a6:定位；a7:細胞組分組織或生物發(fā)生；a8:信號；a9:發(fā)育進程；a10:多細胞有機體進程；a11:生物進程正調(diào)節(jié)；a12:多種生物進程；a13:生殖進程；a14:生殖；a15:生長；a16:細胞增殖；b1:DNA結(jié)合；b2:催化活性；b3:轉(zhuǎn)運活性；b4:轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)活性；b5:分子功能調(diào)節(jié)；b6:抗氧化活性；b7:結(jié)構(gòu)分子活性; b8:分子轉(zhuǎn)運活性；c1:細胞；c2:細胞部分；c3:膜；c4:膜部分；c5:細胞器；c6:細胞器部分；c7:蛋白質(zhì)復合體；c8:胞外區(qū)；c9:膜封閉腔；c10:細胞連接；c11:共質(zhì)體。圖C中，a1:代謝進程；a2:細胞進程；a3:生物調(diào)節(jié)；a4:生物進程調(diào)節(jié)；a5:刺激反應；a6:定位；a7:細胞組分組織或生物發(fā)生；a8:發(fā)育進程；a9:信號；a10:多細胞有機體進程；a11:生物進程正調(diào)節(jié)；a12:多種生物進程；a13:生殖；a14:生殖進程；a15:生長；a16:免疫系統(tǒng)過程；a17:細胞增殖；b1:DNA結(jié)合；b2:催化活性；b3:轉(zhuǎn)運活性；b4:轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)活性；b5:分子功能調(diào)節(jié)；b6:結(jié)構(gòu)分子活性；b7:分子轉(zhuǎn)運活性;b8:抗氧化活性；b9:分子轉(zhuǎn)運活性;c1:細胞；c2:細胞部分；c3:膜；c4:膜部分；c5:細胞器；c6:細胞器部分；c7:蛋白質(zhì)復合體；c8:胞外區(qū)；c9:膜封閉腔；c10:細胞連接；c11:共質(zhì)體；c12:超分子復合物。圖5 TD70和Kasalath在水稻幼穗不同時期差異表達基因的功能分析Fig.5 Functional analysis of differentially expressed genes in TD70 and Kasalath at different stages of young panicles

2.7 2個水稻材料幼穗中差異表達的轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域特定的元件上以調(diào)控基因的表達,在植物生長發(fā)育中起著重要作用。已克隆的粒型基因GW8基因?qū)儆赟BP轉(zhuǎn)錄因子家族,GLW7屬于SPL(Squamosa promoter binding protein-like)轉(zhuǎn)錄因子家族,LG3屬于AP2轉(zhuǎn)錄因子家族,OsMADS1為MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子[6,8,15,38]。由此可見,轉(zhuǎn)錄因子在水稻幼穗發(fā)育中有重要的調(diào)控作用。通過轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)和NCBI的nr數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行注釋,共得到來自43個家族的349個已知或者預測的轉(zhuǎn)錄因子,如圖6所示,其中有3個ARF(生長素相應因子)家族的轉(zhuǎn)錄因子,32個bHLH(Basic helix-loop-helix)家族的轉(zhuǎn)錄因子,34個ERF(乙烯相應因子)家族的轉(zhuǎn)錄因子,10個MADS-box家族的轉(zhuǎn)錄因子,這些差異表達的轉(zhuǎn)錄因子可能對幼穗發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。進一步分析發(fā)現(xiàn),與Kasalath相比，TD70中粒型基因OsLG3在P1期顯著上調(diào)表達,在P2、P3期的表達量沒有顯著差異；GW8基因在幼穗中3個時期均上調(diào)表達,但差異不顯著,GLW7基因的表達模式與GW8基因相反；OsMADS1基因表達量在2個材料間差異不顯著。這可能是由于TD70與Kasalath的遺傳背景差異較大,同時TD70中聚合了多個粒型基因,而不同基因在調(diào)控水平上可能存在互作等。

表3 KEGG通路中10個以上差異表達基因的代謝通路信息

圖6 2個水稻材料幼穗中差異表達的轉(zhuǎn)錄因子分析Fig.6 Analysis of differentially expressed transcription factors in two rice materials

3 討 論

水稻粒型基因的研究一直倍受重視,目前研究者已經(jīng)定位并克隆了大量粒型基因,然而水稻超大籽粒形成的分子機制尚不清晰。本研究對相同發(fā)育階段TD70、Kasalath水稻的幼穗進行比較,在P1、P2和P3發(fā)育階段分別獲得3 618個、4 183個和5 254個差異表達基因,差異表達基因的數(shù)量隨著幼穗的發(fā)育逐漸增加,可能由于在幼穗發(fā)育后期,調(diào)控網(wǎng)絡更加復雜,參與的基因也更多。GO富集分析顯示,這些差異表達基因涉及的生物學途徑主要集中在信號(GO編號:0023052)、細胞增殖(GO編號:0008283)、催化活性(GO編號:0003824)、轉(zhuǎn)運活性(GO編號:0005215)、膜系統(tǒng)(GO編號:0016020)、蛋白質(zhì)復合體(GO編號:0032991)等細胞代謝相關的重要途徑。由此可見,孕穗期幼穗的發(fā)育涉及信號轉(zhuǎn)導、細胞分裂、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等重要進程,這些生物學途徑在孕穗期對水稻幼穗的發(fā)育起到至關重要的作用。以上研究結(jié)果與前人對水稻幼穗的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果基本一致[31-33]。研究發(fā)現(xiàn),GS5、GW7/GL7、GW8等粒型基因通過調(diào)控水稻穎殼細胞周期的變化而調(diào)控粒型[14-16,21]。TD70超大籽粒是多個粒型基因聚合的結(jié)果,不同粒型基因涉及膜蛋白、激素以及各類酶類等大分子相關途徑,通過調(diào)節(jié)穎殼細胞分裂和生長而最終影響籽粒大小[24-26]。通過KEGG數(shù)據(jù)庫對幼穗3個發(fā)育時期都差異表達的基因進行代謝通路的富集分析，結(jié)果顯示,差異表達基因共涉及119條KEGG代謝通路；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、淀粉和蔗糖代謝、碳代謝、激素信號轉(zhuǎn)導等多個通路代謝旺盛。細胞周期蛋白和細胞分裂素相關基因在幼穗發(fā)育的3個時期表現(xiàn)出顯著差異,推測在幼穗發(fā)育過程中2個材料穎殼細胞分裂的差異是后期二者籽粒大小差異的重要原因。通過GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),調(diào)控通路的差異涉及生命大分子物質(zhì)的合成與代謝、激素信號轉(zhuǎn)導及膜系統(tǒng)等,可以為水稻幼穗細胞分裂、生長與分化等生命過程提供重要的物質(zhì)基礎、能量來源以及重要的分子信號等。

轉(zhuǎn)錄因子作為重要的調(diào)節(jié)蛋白,在水稻穗發(fā)育和籽粒形成過程中起著重要作用[39]。本研究發(fā)現(xiàn),在2個水稻材料幼穗中349個轉(zhuǎn)錄因子的表達量存在顯著差異,其中包括AP2、ARF、bHLH、MYB、MADS等家族的轉(zhuǎn)錄因子。在多個物種中的功能鑒定結(jié)果表明,植物中MYB轉(zhuǎn)錄因子家族具有調(diào)節(jié)植物發(fā)育、開花時間等不同的功能[40]。MADS轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生殖器官發(fā)育中起到重要的調(diào)節(jié)作用,OsMADS1基因與水稻G蛋白互作對籽粒大小具有調(diào)控作用[8]。綜上可見,轉(zhuǎn)錄因子對水稻孕穗期幼穗的發(fā)育和籽粒形態(tài)有重要的調(diào)控作用。

本研究通過對不同大小的水稻幼穗進行轉(zhuǎn)錄組深度測序,系統(tǒng)地揭示了特大粒水稻TD70幼穗發(fā)育在不同時期表達譜的變化,為進一步研究水稻籽粒發(fā)育過程中基因互作網(wǎng)絡以及粒型基因在分子育種中的有效利用提供了理論依據(jù)。