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      藏藥豬毛蒿精油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

      2020-09-10 01:40:20祝清燦
      關(guān)鍵詞:薄層色譜質(zhì)譜聯(lián)用丁香酚

      祝清燦

      【摘 要】 目的: 建立豬毛蒿精油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法: 采用TLC法對(duì)豬毛蒿精油進(jìn)行定性鑒別;采用氣相色譜法測(cè)定精油中丁香酚的含量。結(jié)果: 薄層色譜法斑點(diǎn)明顯,分離度好。丁香酚進(jìn)樣量在0.04656~0.4656 μg范圍內(nèi)與峰面積值具有良好的線性關(guān)系,r=0.99999,平均加樣回收率為101.2%,RSD為1.9%(n=6)。結(jié)論: 建立的方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、可靠,重現(xiàn)性好,可用于豬毛蒿精油的質(zhì)量控制。

      【關(guān)鍵詞】 豬毛蒿精油;薄層色譜;氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用;丁香酚

      【中圖分類號(hào)】R284.1 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517(2020)13-0039-05

      Abstract:Objective To establish the quality standard of Artemisiae Scopariae Oil.Methods The TLC method was used to qualitatively identify Artemisia Scoparia Oil.GC-MS was used to determine Eugenol.Results Thin layer chromatography was clear with good separable degree.The linera range for Eugenol was 0.04656~0.4656 μg,(r=0.9999).The average recovery was 101.2%,RSD was 1.9%.Conclusion The established methods were accurate, reliable, reproducible and can be used for the quality control of Artemisia Scoparia Oil.

      Keywords:Artemisia Scoparia Oil;TLC;GC-MS; Eugenol

      豬毛蒿為菊科植物豬毛蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.的地上部分,經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取得豬毛蒿精油。豬毛蒿精油為淺黃色至棕黃色澄清液體,有特異香氣,味微辛,據(jù)文獻(xiàn)[1-4] 報(bào)道, 對(duì)真菌有很強(qiáng)的抑制作用,藏族地區(qū)民間常用于治療手、足癬等皮膚病,是藏藥婦潔搽劑[5]的主要成分之一。豬毛蒿精油化學(xué)成分以單萜為主(80.74%),主要成分有丁香酚、桉葉素、檸檬烯、β-丁香烯、α-蒎烯、β-蒎烯等[6-8]。丁香酚是豬毛蒿精油中的主要成分,具有麻醉、抗菌防腐、殺蟲、解熱、降溫、抗性氧化、抗衰老等藥理作用 [9]。Pinto等 [10]研究發(fā)現(xiàn)丁香酚不僅對(duì)皮膚癬菌屬和曲霉菌屬具有抗菌活性,而且對(duì)氟康唑有天然耐藥的克柔念株菌和易誘導(dǎo)耐藥的光滑念珠菌均表現(xiàn)出較高的抑菌活性,對(duì)金黃色葡萄球菌等12種細(xì)菌具有較好的抗菌作用 [11-12]。

      丁香酚存在于豬毛蒿精油中,是一種極具開發(fā)潛力的活性成分。為了控制豬毛蒿精油產(chǎn)品質(zhì)量,確保臨床療效,本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法進(jìn)行豬毛蒿精油鑒別,采用氣相色譜法(GC—MS聯(lián)用)對(duì)豬毛蒿精油中的丁香酚進(jìn)行含量測(cè)定,為制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與儀器

      安捷倫6890A-5973氣質(zhì)聯(lián)用儀,AB104-N電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),ZF-I三用紫外分析儀,YOKO-ZS薄層色譜成像儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn))。

      丁香酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110725-201414),豬毛蒿精油對(duì)照提取物(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):610007-201501),豬毛蒿由青海省食品藥品檢驗(yàn)所楊鳳梅主任鑒定,化學(xué)試劑為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司),硅膠G預(yù)制板(德國(guó)默克公司生產(chǎn),批號(hào)HX242369)。

      豬毛蒿精油樣品(批號(hào)為20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106),由青海普蘭特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

      2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

      2.1 鑒別 取本品100 mg,加乙酸乙酯1 mL使溶解,作為供試品溶液。另取豬毛蒿油對(duì)照提取物,同法制成對(duì)照提取物溶液。再取丁香酚對(duì)照品,加乙酸乙酯制成每1 mL含5 μL的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[13]試驗(yàn),吸取上述兩種溶液各1 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶ 70∶ 7)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照提取物和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)(A)。置紫外光燈(365 nm)下檢視,供試品色譜中,在與對(duì)照提取物和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)(B)。結(jié)果如圖1所示。

      2.2 丁香酚含量的GC法測(cè)定

      2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:TR-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm,膜厚0.25 μm);載氣為高純氮?dú)?,純?99.999%。流速1.5 mL·min-1;柱溫為程序升溫:初始溫度為80 ℃,以每分鐘5 ℃的速率升溫至140 ℃,再以每分鐘50 ℃的速率升溫至220 ℃,保持3 min;進(jìn)樣口溫度為220 ℃;檢測(cè)器為240 ℃;分流進(jìn)樣,分流比為10∶ 1。理論板數(shù)按丁香酚峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。如圖2所示。

      在上述條件下,在圖2-A中,對(duì)照品丁香酚的峰出現(xiàn)在tR8.99,在圖2-B中,出現(xiàn)與對(duì)照品丁香酚保留時(shí)間相似的峰tR 8.99,應(yīng)為樣品中的丁香酚,且與樣品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離。

      2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取丁香酚對(duì)照品適量,精密稱定,加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的溶液,作為測(cè)定用對(duì)照品溶液。

      2.2.3 供試品溶液制備 取本品約0.1 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

      2.2.4 專屬性試驗(yàn) 對(duì)豬毛蒿油供試品溶液進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析,具體參數(shù)如下:色譜柱:DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣為高純氦氣,純度>99.999%。流速1.2 mL·min-1;柱溫為程序升溫:初始溫度為80 ℃,以每分鐘10 ℃的速率升溫至240 ℃,保持4 min;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;檢測(cè)器為260 ℃;分流進(jìn)樣,分流比為10∶ 1。電離方式:EI;離子源溫度:230 ℃;連接線溫度:280 ℃;四級(jí)桿溫度:150 ℃。結(jié)果:分子離子峰的質(zhì)荷比為164.1,保留時(shí)間(9.96)與丁香酚峰相似,其裂解與丁香酚相同,豬毛蒿精油供試品中丁香酚峰質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(安捷倫Chemstation色譜工作站NIST MS Search 2.0標(biāo)準(zhǔn)譜庫)中丁香酚的質(zhì)譜圖匹配度為98%,其特征離子為77、103、149和164(其中164為定量離子),且對(duì)應(yīng)質(zhì)譜碎片離子的質(zhì)荷比與標(biāo)準(zhǔn)一致,其豐度比偏差在規(guī)定范圍內(nèi),因此可認(rèn)為是同一物質(zhì)。如圖3、圖4所示。

      2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取丁香酚對(duì)照品0.04656g(含量按100.0%計(jì)算),置50mL量瓶中,加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液,濃度為931.2 μg·mL-1。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液,用乙酸乙酯稀釋配制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為: 46.56、93.12、186.2、232.8、465.6 μg·mL-1。分別精密吸取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 μL,注入氣相色譜儀,按照“2.2.1色譜條件”測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),線性回歸方程為:Y= 12599767.5X –23282.6(r =0.99999)。結(jié)果表明:丁香酚進(jìn)樣量在0.04656~0.4656 μg范圍內(nèi)與峰面積值具有良好的線性關(guān)系。

      2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)20180906),分別于0、1、2、4、10 h測(cè)定其峰面積,按上述色譜條件測(cè)定,結(jié)果供試品丁香酚峰面積的RSD=1.7%。表明制備的供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

      2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20180906)精密稱取0.1 g,各6份,按2.2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果丁香酚含量的平均值為:52.52 mg·g-1,RSD為1.6%,說明試驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

      2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取丁香酚對(duì)照品0.04656g(含量按100.0%計(jì)算),置50 mL量瓶中,加乙酸乙酯稀釋至刻度,搖勻,備用(含丁香酚0.9312 mg·mL-1)。

      取同一批號(hào)樣品(批號(hào)20180906,含丁香酚為52.52 mg·g-1)各6份,每份約0.05 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,分別精密加入回收對(duì)照溶液3 mL,按含量測(cè)定的方法制備回收用供試品溶液并測(cè)定含量,計(jì)算丁香酚的平均回收率為101.2%。結(jié)果見表1。

      2.2.9 樣品的測(cè)定 ?取20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106共10批樣品,照上述含量測(cè)定方法測(cè)定丁香酚含量,結(jié)果分別為:60、71、52、63、81、62、65、76、87、48mg·g-1。平均值為66.5mg·g-1,最低值為48mg·g-1。

      經(jīng)過上述方法學(xué)驗(yàn)證和耐用性試驗(yàn)考察,結(jié)果表明:本實(shí)驗(yàn)的色譜條件對(duì)丁香酚的定量測(cè)定專屬性高、重現(xiàn)性好、分離能力強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便。

      3 討論

      3.1 薄層色譜法供試品制備 比較了供試品乙酸乙酯、丙酮和三氯甲烷溶解,以乙酸乙酯為溶劑制備供試品溶液分離度較好,斑點(diǎn)清晰。

      3.2 薄層色譜條件選擇 曾采用環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶ 70∶ 7)、石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(9∶ 1)、苯-丙酮(19∶ 1)等展開劑進(jìn)行分離,結(jié)果表明以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(130∶ 70∶ 7)分離效果最好,特征斑點(diǎn)清晰。

      3.3 丁香酚含量測(cè)定研究 采用GC—MS聯(lián)用技術(shù),比僅采用氣相色譜法測(cè)定含量提高了可靠性和準(zhǔn)確性。分別比較了正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚(30~60 ℃)為提取溶劑的丁香酚含量結(jié)果,結(jié)果表明:以乙酸乙酯作為供試液溶劑,樣品中丁香酚溶解完全,測(cè)得含量較高,故最終選用乙酸乙酯為溶劑。

      3.4 氣相色譜法耐用性考察 采用不同的進(jìn)樣口溫度(210 ℃、220 ℃、230 ℃)、不同的檢測(cè)器溫度(230 ℃、240 ℃、250 ℃)和不同的柱溫(70 ℃、80 ℃、90 ℃)及不同品牌和長(zhǎng)度的色譜柱(TR-5,30 m×0.32 mm,0.25 μm和HP-5,25 m×0.32 mm,0.17 μm)進(jìn)行耐用性試驗(yàn)考察。結(jié)果表明,在不同的進(jìn)樣口溫度、不同的檢測(cè)器溫度、不同的柱溫及不同品牌的色譜柱的小范圍變動(dòng)情況下具有耐用性,均可準(zhǔn)確檢出丁香酚。

      豬毛蒿精油中有較高含量的抑菌有效成分丁香酚,廣泛應(yīng)用于臨床及工業(yè)化中藥制劑的生產(chǎn),因此,建立豬毛蒿精油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),有效控制精油質(zhì)量顯得尤為重要,筆者的研究結(jié)果為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

      參考文獻(xiàn)

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      (收稿日期:2020-03-11 編輯:陶希睿)

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